下调MicroRNA-21对胃癌细胞生物学行为及PTEN表达的影响

目的:探讨抑制MicroRNA 21(miR-21)的表达对胃癌细胞的生物学行为及PTEN表达的影响,并分析miR-21参与肿瘤发生、发展的可能机制。方法:应用细胞瞬转的方法将miR-21 inhibitor转染课题组前期试验证实的miR-21高表达胃癌细胞株,应用细胞增殖试验(CCK8方法)、流式细胞技术(Annexin-Ⅴ标记)、Transwell试验检测抑制胃癌细胞株中miR-21表达后,对其细胞增殖、凋亡、周期、迁移的影响;并用Western印迹技术和双荧光素酶报告载体技术检测下调miR-21后,胃癌细胞株PTEN表达的变化。结果:体外增殖试验显示,下调miR-21后对胃癌细胞株的增殖抑制作用明显(P<0.05);体外凋亡试验显示,下调miR-21能增加胃癌细胞株的凋亡(P<0.05);Western印迹试验显示,抑制miR-21表达后胃癌细胞株PTEN蛋白表达明显增加,荧光素酶相对活性明显增加(P<0.05)。结论:下调miR-21的表达对胃癌细胞株的增殖有明显的抑制作用,且促进其凋亡,能降低其体外迁移能力;下调miR-21后,PTEN活性明显增加;PTEN可能是miR-21参与胃癌发生、发展的靶标之一。     

胃癌基因表达谱和蛋白质表达谱的分析研究

目的从转录组水平和蛋白质组水平寻找胃癌组织与正常胃组织间的差异表达基因和蛋白。方法应用含有14592个已知基因及表达序列标签的cDNA表达谱芯片获取基因表达谱信息．50％以上样本中Cy3／Cy5荧光强度比大于或等于2和小于或等于0．5的基因分别为在胃癌中表达上调或下调的基因。采用双向凝胶电泳（2-DE）分离32例经手术切除的胃癌患者的胃癌组织和正常胃组织总蛋白．对差异表达蛋白质点利用基质辅助激光解析电离飞行时间质谱（MALDI—TOF—MS）进行分析．获取肽质量指纹图谱（PMF）。同时搜索SWISS-PROT数据库鉴定蛋白质。结果与正常组织相比．胃癌组织中差异表达基因共有387个,其中表达上调的有149个基因．上调超过3倍的有29个基因：表达下调的有238个基因．其中下调超过5倍的有21个基因。在蛋白质水平鉴定了15个差异表达蛋白．在肿瘤组织中高表达的有10个．其余5个在肿瘤组织中低表达。胃癌中过表达的基凶与蛋白产物主要与细胞骨架运动、细胞增殖及信号传导有关．表达下调的则主要与细胞免疫防御、毒理代谢有关。结论从转录组水平和蛋白质组水平对胃癌基因表达谱进行分析．不仅有助于从分子水平全方位理解胃癌的发病机制及生物学特性．同时也有助于进一步发现新的胃癌相关标志物和基因治疗的靶点。     

miR-126在胃癌中的表达及其靶基因Crk的鉴定

目的:分析miR-126在胃癌中的表达水平并鉴定miR-126的靶基因,以阐明miR-126在胃癌发生机制中的功能。方法:采用qRT-PCR分别检测miR-126在胃癌细胞株、正常胃黏膜组织、永生化胃黏膜上皮细胞、胃癌及配对癌旁组织的表达水平,并与胃癌组织的临床病理指标进行相关性分析。采用生物信息学方法预测出miR-126的靶基因,并通过荧光素酶报告系统加以验证;采用qRT-PCR及Western印迹法检测miR-126对靶基因mRNA及蛋白质表达水平的影响。结果:qRT-PCR检测结果显示,miR-126在胃癌细胞株中的表达水平明显低于其在正常胃黏膜组织及永生化胃黏膜上皮细胞株的表达水平。miR-126在60例病人的胃癌组织中表达的水平显著低于其在配对癌旁组织中表达的水平;且胃癌组织miR-126表达水平低者,肿瘤组织体积较大,胃壁浸润较深,易发生淋巴结转移,病理分期也较晚。生物信息学分析提示Crk mRNA的3′UTR含有miR-126直接作用的靶序列,荧光素酶报告系统检测进一步验证了该靶序列,qRT-PCR及Western印迹法证实miR-126对Crk蛋白表达的调控发生在转录后水平。结论:miR-126有望成为研究胃癌的新型标志物;miR-126通过对其靶基因Crk的调控参与了胃癌的发生、发展过程。     

D-甲硫氨酸联合化疗对胃癌细胞株代谢周期的影响

目的:通过体外实验观察D-甲硫氨酸(D-Met)合并应用细胞周期特异性化疗药物对胃癌细胞株代谢周期的影响。方法:将人胃癌细胞株SGC-7901分别置于含L-Met、D-Met或以同型半胱氨酸替代Met(Met-Hcy+)的不同培养基中,或在上述诸培养基中分别加入5-氟脲嘧啶(5-FU)。培养48h后,应用流式细胞仪检测细胞周期和凋亡细胞的比例。结果:G0/G1期和G2/M期细胞的比例均示D-Met和Met-Hcy+组低于L-Met组,而S期细胞比例则示D-Met组最高,凋亡细胞比例也以D-Met组诸组为最高;与未加入化疗药物诸组相比,联合应用5-FU后,各组的G0/G1期细胞比例增高,S期和G2/M期细胞比例降低,凋亡细胞比例有所增高。结论:D-Met可干扰人胃癌细胞株的代谢周期,趋向阻滞肿瘤细胞于S期,有助于周期特异性化疗药物5-FU对此期肿瘤细胞的杀份。     

一种简单快速的γδT细胞扩增方法

建立一种特异快速地诱导扩增人外周血γδT细胞的方法。用 5～ 10ml外周血通过CD3细胞的富集、γδ单抗的诱导以及肿瘤细胞刺激的培养体系进行γδT细胞的体外扩增。结果显示 ,γδT细胞能在短时间内快速大量扩增到 10 9～ 10 10 的数量级 ;诱导 4周的CD8、γδ阳性的细胞百分率分别为 42 6 9%和 5 8 6 7% ,明显高于诱导前的 2 3 97%和 6 6 2 % ;γδT细胞对NK敏感的K5 6 2细胞和NK抵抗的Daudi细胞均有较高的杀伤活性 ;γδT细胞对经抗HSP单抗封闭后的Daudi细胞的杀伤率明显下降。该培养体系是一种用血量少、特异、经济、快速的人外周血γδT细胞体外扩增方法。     

综合干预措施对呼吸机相关性肺炎发病率的影响

目的 了解中山医院ICU内呼吸机相关性肺炎(VAP)的发病率趋势,评价干预措施对VAP发病率的影响.方法 2004年9月-2009年12月对中山医院6个ICU进行前瞻性监测,感染控制人员在各ICU收集入住ICU的病例资料≥2次/周,实施了不同的干预措施,包括宣教和培训、氯己定口腔护理,严格的手卫生措施、床头抬高30度等;统计分析和比较VAP的季度发病率.结果 共监测28 533例ICU病例,入住ICU为122 098 d,呼吸机使用率0.32%,发生VAP 481例;VAP发病率平均为12.16例/1000通气日,VAP的死亡率为8.32%,平均延长ICU住院时间14.2 d;通过综合干预措施,VAP发病率从24.57例/1000通气日(2004年10月-2005年9月)下降至5.34例/1000通气日(2009年1-12月).结论 虽然医院VAP发病率仍高于美国,但是近年来采取的综合干预措施已使VAP发病率显著下降.     

肝缺血/再灌注损伤时内皮祖细胞的变化

目的探讨肝脏缺血/再灌注(Ischem ia/Reperfusion,I/R)损伤后骨髓及循环中内皮祖细胞(endothelial progen i-tor cells,EPCs)的数量变化及影响因素。方法BALB/c小鼠随机分为A组(正常对照组),B组(手术对照组),C组(I/R组),术后12、24、48 h,用流式细胞仪测定骨髓和循环中EPCs的数量,分别采用ELISA法和western b lot检测循环中VEGF、TNF-α含量及肝脏VEGF表达,TUNEL法原位检测肝脏内皮细胞凋亡。结果手术创伤可以引起骨髓及循环中EPCs数量的一过性增加(12、24 h,P<0.05),并伴有循环中VEGF、TNF-α的升高(12h,P<0.05)。肝脏I/R后骨髓和循环中EPCs的数量显著增加(P<0.01)并伴有高水平的VEGF、TNF-α(P<0.01),骨髓和循环中EPCs数量与血浆VEGF水平呈线性相关(r分别为0.89和0.86),I/R后12 h肝脏VEGF表达增加。I/R后肝脏血管内皮细胞凋亡明显增加。结论肝脏I/R损伤后骨髓和循环中EPCs数量显著增加,其变化主要源于VEGF的动员和趋化作用,EPCs可能参与了肝I/R后损伤内皮的修复。     

过表达癌胚抗原相关黏附分子6抑制胃癌细胞的凋亡与失巢凋亡

目的:探讨过表达癌胚抗原相关黏附分子6(carcinoembryonic antigen-related cell adhesion molecule 6,CEACAM6)对胃癌细胞凋亡与失巢凋亡的影响。方法:构建CEACAM6真核过表达载体转染胃癌细胞SGC-7901和MKN-45,使其CEACAM6过表达,qRT-PCR、Western印迹验证过表达效果,免疫荧光定位CEACAM6;流式细胞仪检测过表达CEACAM6后胃癌细胞凋亡的变化,失巢凋亡检测其失巢凋亡的变化。结果:转染CEACAM6后,胃癌细胞SGC-7901和MKN-45的CEACAM6分别过表达了30 000倍和4 000倍;在胃癌细胞SGC-7901中凋亡与失巢凋亡分别下降了46.2%和53.8%,在MKN-45中凋亡与失巢凋亡分别下降了71.7%和74.6%。结论:过表达CEACAM6抑制胃癌细胞的凋亡和失巢凋亡,CEACAM6通过抑制胃癌细胞凋亡和失巢凋亡的途径参与胃癌细胞的恶性生长过程。     

单克隆抗体MS57-2.1在胃癌生物学中的实验研究

目的:鉴定单克隆抗体MS57-2.1(简称MS57-2.1单抗)的胃癌特异性,研究MS57-2.1单抗的体外和体内抑瘤功能,为胃癌的靶向治疗提供候选抗体药物。方法:本课题组前期利用4个胃癌细胞株膜蛋白免疫A/J小鼠,通过杂交瘤联合高通量流式细胞技术筛选并获得抗胃癌MS57-2.1单抗。通过流式细胞和ELISA检测MS57-2.1单抗的胃癌特异性。通过免疫荧光技术鉴定MS57-2.1单抗的靶抗原在胃癌细胞的定位。通过体外和体内实验初步研究MS57-2.1单抗抑制胃癌细胞移动以及侵袭的作用。结果:流式细胞检测结果表明MS57-2.1单抗可以高亲和力与特定胃癌细胞株结合,而几乎不与正常人外周血细胞结合。ELISA结果表明MS57-2.1单抗可与胃癌组织膜蛋白结合,而不与幽门螺杆菌及胃癌细胞分泌蛋白结合。免疫荧光检测表明MS57-2.1单抗的靶抗原定位于胃癌细胞膜表面。在Transwell小室迁移和侵袭实验中,MS57-2.1单抗处理后胃癌细胞MKN45和BGC823移动能力受到明显抑制,穿过小室细胞数和穿膜细胞数显著低于无关同型单抗对照组和空白对照组。在裸鼠实验中,MS57-2.1单抗处理组的裸鼠肿瘤播散程度显著低于无关同型单抗对照组和空白对照组。结论:MS57-2.1单抗具有抑制胃癌细胞迁移、侵袭和播散的作用,是胃癌靶向治疗具有潜在应用价值的候选抗体药物。     

表达HTERT的大鼠骨髓间充质干细胞生物学特性研究

目的将含hTERT基因的重组慢病毒液感染大鼠骨髓间充质干细胞(Bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs),鉴定其生物学特性。方法分别将含hTERT基因重组慢病毒液、空病毒液感染大鼠BMSCs,实验分为MSChTERT组、MSC-GFP组和MSC组(未感染组)。体外培养扩增后,通过定量PCR对各组目的基因表达进行检测。观察MSC组及MSC-hTERT组的体外传代次数及细胞形态变化,分析细胞周期。流式细胞仪检测MSC-hTERT组细胞标志物,评估其成骨、成脂分化能力。结果MSC-hTERT组目的基因mRNA表达均高于另两组,体外培养过程中MSChTERT组传代次数和增殖指数高于MSC组,且具备多向分化潜能。结论转染hTERT的BMSCs具备BMSCs同样的生物学特性,且细胞增殖能力加强,可为组织工程研究以及细胞移植治疗提供可靠的种子细胞。