TGF-β_3诱导大鼠前软骨干细胞向软骨细胞特性方向分化及其在KLD-12自组装肽纳米凝胶中的培养

目的 探讨软骨组织工程方法 中修复软骨缺损理想的种子细胞和支架材料. 方法 免疫磁珠分离纯化新生大鼠前软骨干细胞(PSCs),分别采用KLD-12自组装肽纳米凝胶三维培养(实验组)和普通培养瓶平面培养(对照组),用转化生长因子β3(TGF-β_3)诱导两组PSCs向软骨细胞特性方向分化.利用RT-PCR、免疫组化等方法 测定其向软骨细胞特性方向分化过程中特异性细胞外基质Ⅱ型胶原(collagen Ⅱ)和聚集蛋白聚糖(aggrecan)表达的情况. 结果 RT-PCR和免疫组化检测结果表明KLD-12自组装肽纳米凝胶组细胞在诱导7、14 d后均有collagen Ⅱ和aggrecan表达,且RT-PCR检测结果表明KLD-12自组装肽凝胶组细胞的collagen Ⅱ和aggrecan mRNA表达水平较对照组高,其差异有统计学意义(均P＜0.05). 结论 TGF-β_3诱导后的PSCs可向成软骨方向分化,诱导后的PSCs与KLD-12自组装肽凝胶复合有望构建组织工程化软骨,KLD-12自组装肽纳米凝胶是较好的软骨组织工程细胞支架.     

Cyclin D1基因沉默诱发肾癌ACHN细胞增殖受抑的研究

目的 证实Cyclin D1基因作为肿瘤基因治疗新靶点的可行性及发卡环RNA(shRNA)表达载体介导该基因沉默的有效性.方法 设计合成Cyclin D1-shRNA模板片段,与Pgenesil-1-U6载体连接,构建shRNA真核表达载体;将Pgenesil-Cyclin D1-shRNA转入ACHN肾癌细胞株.RT-PCR、Western blot分析Cyclin D1基因mRNA及蛋白表达;MTT比色法绘制细胞生长曲线;流式细胞术测细胞凋亡率;Transwell小室体外侵袭实验检测细胞侵袭.结果 Pgenesil-Cyclin D1-shRNA构建成功.Cyclin D1-shRNA实验组 Cyclin D1 mRNA抑制效果显著(0.10±0.04),明显高于Pgenesil-NC阴性对照组(0.92±0.03)及ACHN空白对照组(0.94±0.04)(均P<0.05).同样,实验组Cyclin D1蛋白表达明显下调.流式细胞术分析提示,Cyclin D1-shRNA组细胞早期及晚期凋亡细胞均较Pgenesil-NC组和ACHN组显著增高.生长曲线显示Cyclin D1-shRNA组细胞生长明显缓慢(P<0.05).Transwell实验同样发现该组细胞侵袭能力显著下降(P<0.05).结论 Cyclin D1可作为肾癌ACHN细胞生物学行为的评判标准.经载体介导shRNA干扰的高效性为肾癌基因治疗提供了实验依据.     

肾上腺髓质素对鼠成骨细胞IGF-Ⅰ及IGF-ⅠR mRNA表达的影响

目的探讨肾上腺髓质素(ADM)对成骨细胞胰岛素样生长因子Ⅰ(IGF-Ⅰ)和胰岛素样生长因子Ⅰ型受体(IGF-ⅠR)基因表达的影响。方法将体外培养的鼠成骨细胞用不同浓度的ADM分别处理12h和24h,通过半定量逆转录聚合酶链式反应(RT-PCR)来观察成骨细胞两种目的基因(IGF-Ⅰ,IGF-ⅠR)的mRNA表达。结果 ADM可以刺激成骨细胞IGF-ⅠmRNA表达,以10-11 mol/L作用12h最明显。ADM亦可上调成骨细胞IGF-ⅠR mRNA表达,可维持24h。结论 ADM可以通过增强IGF-Ⅰ的表达调节成骨细胞活性。     

他克莫司对周围神经损伤后脊髓组织中肝细胞生长因子表达的影响

[目的]探讨他克莫司对大鼠周围神经损伤后脊髓组织中肝细胞生长因子 (HGF) 表达的影响.[方法]成年雄性大鼠 50 只,随机分为正常组、损伤组和治疗组,后两组行双侧坐骨神经切断.术后治疗组颈后皮下注射他克莫司 (1 mg/kg),损伤组注射生理盐水.术后不同时间点取 L4～6脊髓,应用 Western blotting 技术及免疫荧光标记对脊髓组织中HGF 的表达变化进行定量和定位检测.[结果]HGF 在脊髓灰质前角、中间带和后角的各类神经元中均有表达;损伤组与正常组大鼠脊髓组织中 HGF 的表达之间无显著性差异 (P>0.05),治疗组大鼠脊髓组织中 HGF 的表达在术后 7、14 d 时明显高于损伤组 (P< 0.05).[结论] (1) 周围神经损伤本身并不能使脊髓组织中 HGF 的表达上调;(2) 他克莫司能诱导周围神经损伤后内源性 HGF 的高表达,从而保护相应神经元,促进轴突生长.     

医院危机事件中的媒体沟通探讨

现代媒体的医疗报道越来越强烈地影响到社会公共安全和政府决策人员及民众的价值观点,同时也影响到医疗卫生从业人员的情绪。媒体应当客观、专业地报道各项医疗卫生事件。然而,目前实际状况不容乐观。阻碍医疗报道质量提高的因素主要有缺乏相关知识、商业市场竞争、专业术语理解匮乏、医疗事件内情了解困难等。医疗报道十分重要,只有医院专业人员与媒体实时交换信息,协同报道各类危机事件,才能有效提高医疗新闻的客观真实性,才能使医疗卫生从业人员与社会大众相互理解。     

肺癌肿瘤抑制物-1基因在肾腺癌伴骨转移组织的表达及临床意义

目的探讨肺癌肿瘤抑制物-1(TSLC1)基因在肾腺癌伴骨转移组织中的表达及其与临床病理特征的关系。方法采用免疫组织化学(SP)法检测TSLC1在54例肾腺癌无骨转移患者的癌组织标本,10例肾腺癌伴骨转移患者的癌组织标本及10例正常肾组织中的表达。结果 TSLC1蛋白在肾腺癌无骨转移患者的癌组织中阳性表达率为53.7%(29/54),在肾腺癌伴骨转移患者的癌组织中阳性表达率为2/10,在正常肾组织中的阳性表达率为10/10,三组间差异有统计学意义(P<0.05)。TSLC1蛋白在肾腺癌病理分级Ⅰ～Ⅱ级中阳性表达率为54.0%,在Ⅲ级中阳性表达率为21.4%,差异有统计学意义(P<0.05);在肾腺癌伴发骨转移患者的癌组织中阳性表达率为20.0%,在无骨转移患者的癌组织中阳性表达率为61.1%,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 TSLC1基因可能与肾腺癌伴发骨转移的发生、发展有关,可能对肾腺癌伴发骨转移的早期诊断及预后评估具有重要意义。     

体外RNA干扰抑制ACP1对骨肉瘤细胞侵袭的影响

目的探讨ACP1蛋白对人骨肉瘤细胞侵袭能力的影响。方法以骨肉瘤细胞MG-63为研究对象,针对ACP1基因设计小干扰RNA（si RNA）,构建其短发夹状RNA（short hairpin RNA,shRNA）真核表达载体并转染入细胞,在mRNA和蛋白水平检测ACP1表达,通过黏附实验、细胞划痕、transwell检测MG-63体外侵袭能力。结果成功构建si RNA表达载体Pgenesil-1/ACP1-shRNA。shRNA可使ACP1在基因和蛋白表达水平显著降低,骨肉瘤细胞的迁移能力明显下降,黏附能力由（96.4±8.8）%到（43.4±6.0）%,P〈0.01;穿过人工基底膜的细胞数量明显减少,由56.5±4.8减少到36.3±6.1,P〈0.05。结论ACP1在骨肉瘤的侵袭过程中发挥着重要作用,为肿瘤的生物学治疗提供了新思路。     

Construction of Sox9 gene eukaryotic expression vector and its inductive effects on directed differentiation of bone marrow stromal cells into precartilaginous stem cells in rats

Sox9 gene was cloned from immortalized precartilaginous stem cells and its eukaryotic expression vector constructed in order to explore the possibility of bone marrow-derived stromal cells differentiation into precartilaginous stem cells induced by Sox9. A full-length fragment of Sox9 was obtained by RT-PCR, inserted into pGEM-T Easy clone vector, and ligated with pEGFP-IRES2 expression vector by double digestion after sequencing. The compound plasmid was transfected into born marrow-derived stromal cells by Lipofectamine 2000, and the transfection efficacy and the expression of Sox9 and FGFR-3 were observed. Flow cytometry was used to identify the cell phenotype, and MTT was employed to assay proliferative viability of cells. Sequencing, restrictive endonuclease identification and RT-PCR confirmed that the expansion of Sox9 and construction of Sox9 expression vector were successful. After transfection of the recombinant vector into bone marrow-derived stromal cells, the expression of Sox9 and FGFR-3 was detected, and proliferative viability was not different from that of precartilaginous stem cells. It was concluded that Sox9 gene eukaryotic expression vector was successfully constructed, and the transfected bone marrow-derived stromal cells differentiated into the precartilaginous stem cells.     

大鼠骨骺干细胞免疫纯化和Sox9基因真核表达载体的克隆构建*★

目的：Sox9基因是一种重要的早期胚胎发育相关基因，是前软骨细胞浓聚所必需的因子，其促进成骨但同时可以抑制骨骺细胞的终末分化，以延长软骨发育成熟过程，延迟软骨发育，抑制软骨细胞凋亡，有利于骨骼在生长发育阶段形成复杂的形状和结构。从骨骺干骨细胞中克隆得Sox9基因，并构建其真核表达载体。 方法: 实验于2007-03/07在同济医学院矫形外科实验室完成。①实验材料：出生< 24 h纯系清洁级新生SD大白鼠，由华中科技大学同济医学院实验动物中心提供，实验过程中对动物处置符合动物伦理学标准。②实验方法：参考游洪波等方法，采用免疫磁珠技术分离纯化具有FGFR-3特异性表面标志的大鼠骨骺干细胞，以FGFR-3抗体对骨骺干细胞的细胞爬片进行免疫细胞化学鉴定。提取骨骺干细胞总RNA，以RT-PCR方法获得Sox9基因的全长，插入pGEM○R-T Easy Vector System克隆载体中进行序列测定，测序正确后将其亚克隆至表达载体pEGFP-IRE2构建重组复合质粒。 结果:免疫组织化学证实，显微取材分离并纯化的细胞为骨骺干细胞。从骨骺干细胞中提取的总RNA经电泳可得28 s、18 s和5 s共3条带，测吸光度值为0.263 5，A 260 / A 280为1.874 1，说明提取的总RNA完整性较好，纯度高，符合RT-PCR的要求。PCR产物经电泳可得到约2 000 bp的特异性条带，与预期大小一致。经限制性内切酶酶切图谱分析DNA序列测定证实的目的基因已经插入重组质粒，成功地构建了Sox9质粒。 结论：成功地分离纯化了骨骺干细胞，克隆出Sox9基因并构建了Sox9基因的真核表达载体，为进一步研究Sox9的生物学功能及其在成软骨和成骨分化过程中的作用奠定了基础。     

pTet-on骨骺干细胞株的建立和pTRE-甲状旁腺相关蛋白(1-36)反应质粒的构建

目的 建立pTet-on骨骺干细胞株,克隆甲状旁腺相关蛋白[PTHrP(1-36)]基因并构建反应质粒pTRE-PTHHrP(1-36).方法 用脂质体介导的基因转染技术将pTet-on质粒转染于永生化骨骺干细胞,G418筛选得到稳定克隆,再瞬时转染pTRE-2Hyg-Luc质粒并筛选出高水平诱导、低背景表达的永生化骨骺干细胞系.以RT-PCR方法获得带有酶切位点PTHrP(1-36)基因片段,与载体pTRE-2Hyg均双酶切后连接,转化扩增后对重组质粒进行提取和酶切、测序鉴定.结果 筛选到1株诱导后荧光素酶的表达活性增加50倍的骨骺干细胞系;经酶切图谱分析和DNA序列测定证实目的基因已经插入重组质粒.结论 筛选得到的永生化骨骺干细胞株受强力霉素诱导后能够低背景、高水平表达;成功克隆PTHrP(1-36)基因并构建了反应质粒pTRE-PTHrP(1-36),为进一步精确调控PTHrP(1-36)基因的表达奠定了基础.