腺病毒介导的人内皮型——-氧化氮合酶基因和增强型绿色荧光蛋白基因在大鼠骨髓间充质干细胞中的表达

目的：研究腺病毒载体介导人内皮型一氧化氮合酶（human endothelial nitric oxide synthase，heNOS）和增强型绿色荧光蛋白（enhanced green fluorescent protein，EGFP）在体外培养的大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的表达。方法：体外培养、扩增大鼠骨髓间充质干细胞，并对培养的细胞进行成骨、成脂肪诱导分化和细胞免疫表型鉴定；用PmeI线性化后去磷酸化的pShuttle—heNOS—EGFP转化含腺病毒骨架质粒pAdEasy--1的感受态BJ 5183，使其在细菌内发生同源重组，获得阳性重组质粒pAdEasy—heNOS—EGFP。重组质粒经PCR、酶切和测序鉴定正确后经Pac I酶切，转人AD 293细胞，包装成重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP。用重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP对MSCs进行转染，并用荧光显微镜及免疫荧光染色法观察转染细胞内EGFP和heNOS蛋白质的表达。结果：pShuttle—heNOS—EGFP与pAdeasy--1在BJ 5183中成功地发生了同源重组，得到了重组腺病毒质粒pAdEasy—heNOS—EGFP。重组质粒在AD 293细胞中包装成重组腺病毒Ad—heNOS—EGFP。经基因转染的MSCs中高表达heNOS和EGFP。结论：采用腺病毒载体可以将外源性的heNOS基因转染至MSCs中，并得到有效表达，且携带的EGFP标记可以直观地检测靶细胞感染和外源基因的表达情况，这将为勃起功能障碍的细胞治疗提供一条新的途径。     

老年胃肠道肿瘤切除术患者术后认知功能障碍的危险因素分析

目的 筛选老年胃肠道肿瘤切除术患者术后认知功能障碍(POCD)的相关危险因素.方法 选取2018年6月—2020年6月中南大学湘雅三医院在全身麻醉下行择期胃肠道肿瘤切除术的老年患者221例.使用简易精神状态量表(MMSE)评估认知功能.根据患者是否发生POCD分为POCD组和非POCD组;根据患者发生POCD严重程度分...     

不同转染方式对腺病毒介导的基因转染效率的影响

目的:研究携带绿色荧光蛋白(Green Fluorescent Protein,GFP)基因的重组腺病毒在大鼠骨髓间充质干细胞(MSCs)中的表达。方法:将纯化的GFP重组腺病毒分别用单次转染和多次转染两种不同方法转染MSC,观察其感染效率和GFP表达水平。结果:培养的MSC呈CD90和CD105强阳性,且具有成骨、成脂肪等多向分化能力;携带绿色荧光蛋白基因的重组腺病毒单次转染和多次转染P3代MSC都呈现出浓度依赖性;单次转染在80MOI时转染效率最高,而多次转染在20MOI时转染效率即已达90%。结论:建立稳定、高效表达Ad-GFP的骨髓间充质干细胞实验体系,为MSC的标记及示踪奠定基础。     

PEP-1肽介导人Cu,Zn-SOD转导入大鼠离体缺血再灌注损伤心脏

目的:构建原核表达载体pET15b-PEP-1-SOD1,观察PEP-1-SOD1融合蛋白在大鼠离体缺血再灌注损伤心肌组织内的转导能力和转导的目的蛋白是否具有酶活性。方法:构建原核表达载体pET15 b-SOD1和pET15b-PEP-1-SOD1,分别转化大肠杆菌,表达和纯化SOD1和PEP-1-SOD1融合蛋白。采用Langendorff灌流系统,大鼠离体心脏停灌30 min后复灌60 min建立缺血再灌注损伤模型。实验分为对照组,SOD1组,25,50,100μmol/L PEP-1-SOD1组。免疫荧光检测PEP-1-SOD1的转导效果,SOD试剂盒检测酶活性。结果:在荧光显微镜下,PEP-1-SOD1融合蛋白预处理组心肌组织中可见特异性的绿色荧光位于心肌细胞胞质内,25,50,100μmol/L组阳性率分别为32.6%,42.5%,60.9%。SOD1蛋白预处理组和对照组未见到绿色荧光。与对照组相比,PEP-1-SOD1各组SOD酶活性均显著增加(P<0.01),且SOD酶活性与PEP-1-SOD1浓度呈正相关,SOD1组与对照组之间无显著性差异(P>0.05)。结论:PEP-1-SOD1融合蛋白以天然有活性的形式穿透进入大鼠离体缺血再灌注损伤的心肌细胞,且具有剂量依赖性。转导入细胞内的PEP-1-SOD1蛋白具有酶活性。本研究为SOD1治疗由氧化应激所导致的各种疾病提供了一种有效的递送途径。     

综合评价方法与鼠疫防治

现代综合评价方法在医学实践中得到了广泛应用并取得了理想的效果,但在鼠疫防治领域,综合评价方法的使用尚不多见。挖掘鼠疫防治资源信息、选用适宜的综合评价方法对鼠疫防治工作进行综合评价,将有助于提高鼠疫防治工作效率,能够为进一步改进鼠疫防治工作模式、选用科学的防治策略和措施提供可靠依据。     

hSDF-1α/CXCR4介导骨髓源间充质干细胞迁移的信号转导

目的:利用Boyden chamber体外迁移体系初步探索基质细胞衍生因子-1(SDF-1)在骨髓源间充质干细胞(MSC)迁移中的作用及其信号转导机制. 方法:采用经典的全骨髓贴壁法培养MSC, 通过成骨、成脂肪等多向诱导分化以及流式细胞仪分析其表面标记(CD133,CD34,CD90,CD105)等鉴定MSC特征;以P3-MSC为实验材料,利用Boyden chamber体外迁移体系,观察不同浓度的hSDF-1对MSC迁移的影响,以50 nmol渥曼青霉素,10 mmol LY294002,50 mmol PD98059,10 mmol U73122,0.1 g/L AMD3100等不同处理P3-MSC,观察最适宜浓度的hSDF-1对MSC迁移影响的信号转导机制. 结果:培养的MSC呈现出CD90,CD105强阳性,具有成骨、成脂肪等多向分化能力;MSC体外迁移能力随着hSDF-1α浓度(1,10,100,500 μg/L)的递增而逐渐增强,并且hSDF-1α浓度在100 μg/L时,MSC迁移到滤膜上的细胞数接近于峰值;渥曼青霉素,LY294002,PD98059,U70312,AMD3100,维拉帕米对MSC迁移均有影响,其中U73122,AMD3100对MSC迁移阻断的效应最显著. 结论:SDF-1/CXCR4所介导的MSC迁移与丝裂原活化蛋白激酶(MAPK),磷脂酰肌醇特异性磷脂酶C和蛋白激酶C(PKC)等信号途径有关, 且PKC途径可能处于中心环节.     

PEP-1介导增强型绿色荧光蛋白转导入人主动脉平滑肌细胞

目的:研究细胞穿透肽PEP-1携带大分子蛋白穿透人平滑肌细胞的能力。方法:用基因工程的方法制备并纯化EGFP蛋白和PEP-1-EGFP融合蛋白,将纯化后的两种蛋白和培养的人平滑肌细胞共同孵育,在荧光显微镜下直接观察PEP-1介导目的蛋白EGFP转导入人平滑肌细胞的能力。结果:EGFP蛋白不能进入细胞内,PEP-1-EGFP融合蛋白和人平滑肌细胞共同孵育1h后可见有明亮绿色荧光分布于胞浆和胞核。结论:PEP-1能有效携带目的蛋白进入人平滑肌细胞,这为将来用细胞穿透肽PEP-1介导有生物活性的大分子抗平滑肌细胞增殖进行血管成形术后再狭窄的蛋白治疗奠定了基础。     

原位W形回肠膀胱的尿动力学分析

目的:分析原位W形回肠膀胱的尿控效果。方法:对15例全膀胱切除原位W形回肠膀胱患者行尿动力学检查,测定尿流率、残余尿、储尿期回肠膀胱的顺应性、稳定性、回肠膀胱感觉、回肠膀胱容量及排尿期回肠膀胱收缩力。结果:本组患者15例,随访6~24个月,平均17个月。15例患者白天完全可控,14例患者夜间完全可控,溢尿1例。最大尿流率5.3~23.5 mL/s,平均14.6 mL/s。残余尿0~115 mL,平均45.5 mL。顺应性30~35 mL/cm H2O,平均33.5 mL/cm H2O。储尿期回肠膀胱较少出现无抑制性收缩,压力0~15 cmH2O,平均11.2 cmH2O。回肠膀胱感觉减退,无明显最初排尿感、正常排尿感。回肠膀胱容量为270~650 mL,平均405.7 mL。回肠膀胱内压力10.37~32.60 cmH2O(1cmH2O=0.098 kPa),平均21.65 cmH2O。排尿期均为腹压协助排尿。结论:原位W形回肠膀胱储尿囊压力低、控制排尿满意,是一种理想的尿流分流手术。     

武当山镇农村居民患病状况影响因素分析

目的 :了解武当山镇农村居民健康状况及影响因素。方法 :采用分层整群随机抽样方法 ,对武当山镇 2 74户家庭共 80 8个农村居民进行了家庭健康的抽样调查。结果 :武当山镇农村居民的两周患病率为 17.1% ,对两周患病率的主要影响因素不具有人口学特征 ;慢性病患病率为 11.8% ,对慢性病患病率的主要影响因素为年龄、文化程度和经济状况。结论 :武当山镇农村居民的两周患病率较高 ,建议针对影响居民健康的主要危险因素开展预防保健工作 ,提高居民的健康水平     

PEP-1介导血红素加氧酶-1导入肝细胞的实验研究

目的采用体外培养的L02肝细胞株,研究PEP-1肽介导血红素加氧酶-1（PEP-1-HO-1）穿透肝细胞的能力。方法实验分为PEP-1-HO-1组和HO-1组,用基因工程的方法制备并纯化PEP-1-HO-1融合蛋白,将纯化的目的蛋白及HO-1蛋白加入培养的L02肝细胞,通过免疫荧光及western blot来分析其转导能力。结果经测序分析证实,原核表达质粒pET15b-PEP-1-HO-1重组成功。SDS-PAGE及western blot结果表明,PEP-1-HO-1在Rosetta（DE3）pLysS菌中获得了高效表达,经Ni2＋-NTA-树脂柱亲和层析纯化得到了融合蛋白PEP-1-HO-1,将其加入到体外培养的L02肝细胞培养基中,发现它能以剂量依赖及时间依赖的方式转导入细胞内,并能持续稳定表达48h,免疫组化显示其主要分布于胞质和胞核中。结论 PEP-1-HO-1融合蛋白能高效地转导入培养肝细胞,为进一步研究肝细胞氧化应激损伤防治的动物模型实验提供了新的途径。