重组人IL-6D24-PE40外毒素融合蛋白的构建及其生物学效应

目的 构建重组人白细胞介素6－绿脓杆菌外毒素融合蛋白IL－6D24－PE40,以选择性杀伤高表达IL－6受体（IL－6R）的肿瘤细胞和白血病细胞。方法 采用重叠延伸的基因融合技术将N－末端缺失24个氨基酸的重组人白细胞介素6（IL－6D24）cDNA与缺失细胞结合区的绿脓杆菌外毒素PE40基因进行融合,构建IL－6D24－PE40融合基因。利用HB101／pBV220表达系统,实现了IL－6D24－PE40融合蛋白在大肠杆菌中的高效表达,经MonoQ柱进行层析纯化,采用MTS法检测细胞毒活性。结果 IL－6D24－PE40融合蛋白在大肠杆菌中的表达水平达到40％－60％。包涵体蛋白经分离、复性及纯化得到纯度＞95％的融合蛋白。Western blot证明,纯化的融合蛋白与IL－6抗体及PEA抗体均发生特异性结合。细胞毒活性检测证实,IL－6D24－PE40融合蛋白能高度特异地选择性杀伤高表达IL－6R的U937细胞,ID50约为250ng/ml,而对不表达IL－6R的CEM细胞无杀伤作用。结论 IL－6D24－PE40融合蛋白能够选择性杀伤高表达IL－6R的靶细胞,有希望成为导向治疗高表达IL－6／IL－6R系统的某些白血病和其他肿瘤的新型导向药物。     

造血干细胞移植中供—受体配型选择新标准—HLA分子模拟三维结构匹配

为了确定人类白细胞抗原（HLA）三维结构配型的标准,总结出主要的可允许错配和免疫原性错配等位基因。我们采用分子模拟技术模拟了HLA分子的三维结构。用计算机软件比较模拟结构间的差异大小,结果表明,HLA分子模拟结构间的差异不同,在大量统计分析基础上可以认为,HLA-A和-B分子整体相对均方差（relative mean square deviation,RMSD,单位nm)大于0.04nm为差异显,小于0.02nm为差异不显;DRB1位点间RMSD大于0.02nm为差异显,小于0.01nm为差异不显,据此进一步总结了主要的可允许错配和免疫原性错配等位基因情况。本研究提示,HLA三维结构配型是移植配型领域的新观点,值得进一步深入研究。     

HLA抗血清的筛选

<正> 我们从6000份产妇的产道血中筛选出336份HLA特异性抗血清,阳性率为5.6％。这些血清经过三个实验室的标准细胞的鉴定。经计算机处理,其中104份血清的r值在0.6和0.6以上,包括37个特异性,特别是国际上较难筛选到的BW46抗血清。现将具体结果报告于下。     

细胞因子-受体介导靶向杀伤白血病细胞的新策略IL-6/IL-6R系统介导重组IL-6-PE40外毒素融合蛋白的特异性杀伤

鉴于白血病细胞异常高地表达IL-6/IL-6R系统,而正常造血细胞几乎不表达抑或微量表达这一事实,我们本研究率先在国际上开展了利用IL-6/IL-6R系统介导重组IL-6-PE40外毒素融合蛋白特异性杀伤高表IL-6R白血病新策略的科学性及可行性的探讨.构建并表达及纯化IL-6-PE40;应用核酸及蛋白质序列软件GOLDKEY系统计算机模拟分析IL-6-Linker-PE40及IL-6-PE40的柔性、抗原性、亲水性及表位等分子生物学特性;建立了表达人IL-6R的大鼠急性早幼粒白血病细胞模型;鉴定了人IL-6R基因在LT12中的表达;分析了人IL-6R基因的整合对LT12-IL-6R~ 细胞模型生物学特征的影响及IL-6-PE40对白血病及正常造血细胞的体外作用和IL-6R的白血病及正常大鼠的体内效应.结果发现:①利用     

HLA-A*02等位基因分型技术及汉族HLA-A*02多态性研究

建立高分辨率的套式ＰＣＲ－ＳＳＰ,对１７个ＨＬＡ－Ａ０２等位基因分型,利用国际标准分型细菌进行特异性鉴定,并在５４例Ａ０２阳性的无血缘关系汉族健康人中应用,共检测到５个Ａ０２亚型,显示出较高多态性,其中Ａ０２１１首次在东方人群检测到;Ａ０２０１频率最高,申有４８;２％;其余依次为Ａ０２１０６,Ａ＾＊０２０７和Ａ＾＆０２０３．     

HLA-DRB1、HLA-DRB3、HLA-DRB4、HLA-DRB5与HLA-DQ位点不关联病例的研究

目的:完善目前已知的HLA-DR与HLA-DQ关联表。方法:从2000~2006年间到我们实验室配型的供患者中选出与关联表不相符的16例标本并对这些标本进行高分辨鉴定。结果:发现在中国汉族人中的五条HLA-DR与HLA-DQ位点连锁遗传的单倍体。结论:为目前所用的HLA-DR与HLA-DQ位点关联表在中国人群中增加五个新的单倍体,使关联表更适合于中国人群。     

HLA-Cw位点低分辨基因分型"纯合子"的等位基因特性研究

目的 研究HLA-Cw位点低分辨基因分型"纯合子"的等位基因特性,为临床移植配型提供精确资料.方法 在43例血缘关系造血干细胞移植(HSCT)供受者中,对中国最常见的低分辨基因分型Cw*03和Cw*07的"纯合子"个体采用聚合酶链反应-序列特异性引物(PCR-SSP)高分辨基因分型方法 进行等位基因定型,并采用自主研制的三维结构匹配软件系统(HLA StrucMark version1.0)对其等位基因产物进行三维结构匹配,以预测不同分辨率分型结果 对移植物抗宿主病(GVHD)发生的影响.结果 低分辨基因分型Cw*03、Cw*07"纯合子"个体的高分辨基因分型结果 显示Cw*03及Cw*07的纯合子分别为14%和43%,其余均为Cw*03及Cw*07杂合子个体.可见其低分辨基因分型易造成供受者问等位基因的错配;在有家系校正的情况下,标本的低分辨模糊结果 可以通过家系遗传分析来校正定型;在无家系校正的情况下,应通过高分辨基因分型来确定等位基因,三维结构差异分析则显示这些错配有可能造成HSCT后GVHD的发生.结论 当低分辨基因分型结果 只出现Cw位点"纯合子"时,有家系的标本应当以家系分型结果 校正定型,无家系校正的标本应当用高分辨基因分型方法 进行核实,从而为临床移植提供准确的配型报告,以防止无关供-受者HSCT后因等位基因错配而引起的严重GVHD.     

异基因骨髓移植后引发间质性肺炎一例

患者，女性，32岁，1995年11月21日经骨髓穿刺诊断为慢性粒细胞性白血病慢性期入院治疗，HLA配型结果与供体一致，人巨细胞病毒（HCMV）阴性。供筛选的供髓相合者两列均为男性，其中一例HCMV阳性被选为供体。患者在骨髓移植后未接受过其它血液制品输往，于63天因患间质性肺炎再次前来检查HCMV，其结果阳性。从而证实由于移植了带有HCMV阳性的供髓而使受者HCMV转为阳性，且并发引起间质性肺炎。我们认为，在检测移植供、受体HLA配型时，应同时检测HCMV是完全必要的，为防止由于移植后而引起新的疾病。对移植HCMV阳性供体的患者…     

中国北方汉族人群中HLA-B27基因多态性与强直性脊柱炎的关联研究

目的首次通过大宗病例对照研究来探讨HLA-B27基因多态性在中国北方汉族强直性脊柱炎(AS)患者以及健康对照人群中的分布情况并研究B27多态性与AS的关联性。方法选用602例北方汉族AS病例和694例健康无关对照进行病例对照研究。HLA-B27基因多态性分析采用序列特异引物介导的PCR反应(PCR-SSP)方法。关联性分析采用卡方检验。结果在AS患者及健康对照中分别有82.4%和7.5%的个体为B27阳性。关联分析证实B27与AS之间存在强相关性(OR=58,p=6.5×10-163)。本研究共发现5种B27基因多态性,B*2705、B*2704、B*2702、B*2707和B*2724,其中B*2704、B*2705和B*2702都与AS有强相关性,而B*2704的相关性最强(P=1.4×10-68),但是B*2705诱发AS的危险度却高于B*2704;B*2707和B*2724与AS则没有相关性。另外,北方汉族与上海、广东、台湾地区AS患者中B27基因多态性的分布有较大差异(其中B*2705差异最显著,P=6.28×10-52);而且4个地区人群中不同B27基因多态性诱发AS的风险度也有明显不同。结论本研究证实B27与AS之间存在高度相关性,并首次发现B*2704虽与北方汉族人群AS发病最为相关,但其诱发AS的相对危险度却低于B*2705。B27基因多态性在AS患者中的分布是存在地域差异的,这一现象提示不同地区汉族人群的AS在遗传学发病机制上是有其独特性的。     

HLA-I类PCR-SSP基因分型在异基因造血干细胞移植中的应用

目的：提高异基因造血干细胞移植供、受者HLA－I类配型的精确度,有效防止移植物抗宿主病（GVHD）的发生。方法 采用准确、简便的DNA、RNA提取方法和HLA－I类PCR－SSP基因分型方法。建立HLA－A33、A68、B40、B13 PCR－SSP分型方法以及HLA基因序列测序分析。结果：对300例中清学难以判断结果的30例临床标本进行基因水平的研究发现,DNA及RNA提取方法可以满足此项研究对样本的要求。HLA－I类PCR－SSP分型方法具有良好的稳定性、可靠性和特异性;重复率达100％。同时,HLA－A33、A68、B40、B13结果与HLA－I类PCR－SSP分型结果一致。HLA基因测序分析进一步肯定了HLA－I类PCR－SSP分型的特异性。HLA－I类PCR－SSP不受某些血清学影响因素的干扰。整个实验过程仅耗时2．5h。结论：HLA－I类PCR－SSP基因分型方法准确、特异、重复性好,可作为临床骨髓移植配型和正常人群无关供者筛选的常规方法,对GVHD的发生必将起到重要的预防作用。