口腔医学中组织工程骨修复骨量不足的研究进展

在口腔医疗实践过程中,常遇到骨量不足的问题。目前,临床应用的植骨材料包括自体骨、异体骨、异种骨和生物医学材料等,每种植骨材料均有其特定的优势但又存在着各自的不足。近年来,随着组织工程学的发展,使组织工程骨替代传统植骨材料用于修复口腔颌面部的骨量不足成为可能。本文就目前在此方面的科研和临床研究进展作一综述。     

以β-磷酸三钙多孔陶瓷为载体建造组织工程化人工软骨

目的 通过将软骨细胞接种到三维多孔β－磷酸三钙（β－TCP）陶瓷支架材料上,探讨以β－TCP为载体建造组织工程化软骨的可行性。方法 将β－TPC多孔陶瓷加工成圆片状,并将其作为构建人工软骨的细胞支架。在支架材料上接种从兔关节软骨分离的软骨细胞,将细胞－陶瓷复合体置于旋转细胞培养系统（RCCS）内,培养1周后,将其移植到裸鼠背部皮下。植入术后4,8,16周取材,进行大体观察、组织学及组织化学等观察。结果 复合体体内移植后,在裸鼠皮下有新生软骨形成,形成的软骨基本保持了支架材料原有形态。结论 β－TPC多孔陶瓷是软骨细胞较适宜的贴附基质,以其为支架能够在体内建造出具有精确解剖形状的人工软骨。     

人骨髓间质干细胞体外扩增和向成骨细胞分化的实验研究

骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，在体外不仅可分化为间质类细胞，而且可以分化为非间质细胞。本研究探讨人骨髓间质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件。利用密度为1．073g/ml的Percoll分离骨髓的单个核细胞，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养与扩增MSCs，细胞纯度可达95％左右。取第二代和第三代的MSCs，以含有不同浓度的抗坏血酸、β－磷酸甘油、地塞米松的诱导培养基向成骨细胞诱导，诱导向的细胞呈现典型的成骨细胞样改变，免疫组化技术显示其I型胶原染色阳性，ALP染色阳性，表明MSCs在体外具有向成骨细胞分化的潜力。     

人牙髓细胞DPDP-2基因的克隆、测序及序列分析

目的:在人牙髓细胞中克隆DPDP-2基因,研究其可能的功能.方法:体外培养HDPC和人牙龈成纤维细胞(HGF),应用基于PCR的改良消减杂交技术构建HDPC和HGF cDNA消减文库,批量克隆HDPC和HGF的差异表达基因并测序,使用GenBank的BLAST对测序结果进行同源序列比较,并运用计算机软件PC/GENE 6.60版对筛选到的DPDP-2基因进行结构和功能分析.结果:DPDP-2基因序列全长810 bp,没有一个完整的编码区. 可与KIAA0265 gene拼接成一个长6172 bp的完整序列,编码一个含有83个氨基酸的疏水性蛋白,其二级结构由螺旋结构、卷曲结构和伸展部分所组成. 它们可以通过α,β或α/β折叠而形成三级结构. 抗原表位分析发现它可能有3种抗原决定簇结构,即Glu-Asn-Lys-Arg-Thr-Gly,Leu-Ile-Glu-Arg-Leu-Lys和Glu-Leu-Ala-Trp-Glu-Lys. 该蛋白存在一种跨膜螺旋结构和线粒体运输肽结构. 进一步的分泌信号分析结果也证实它是一种非分泌蛋白. 经BLAST同源蛋白质搜索,在Non-redundant SwissProt sequences和PDB protein database中均未查询到同源蛋白质.结论:DPDP-2所编码的蛋白是一种跨膜蛋白,具有信号转导分子的结构特征,又具有CKⅡ的磷酸化位点,可能与细胞分裂、转录调节过程有关.     

变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因特异片段的克隆和在大肠杆菌中的表达

目的：克隆变形链球菌葡聚糖结合蛋白C基因（Glucan-binding protein C gene,gbpC）编码序列的特异片段,并在大肠杆菌中实现原核表达。方法：根据gbpC序列设计并合成一对寡核苷酸引物,PCR扩增位于gbpC编码序列1342bp～1794bp间的一段特异片段,扩增产物经回收、酶切后,定向插入克隆载体puc18中,连接产物转化感受态大肠杆菌DH5a,挑选阳性克隆,鉴定后进行序列测定。将克隆获得的约0．45kb的gbpC基因特异片段经EcoRI／SalI双酶切后,定向插入pGEX-4T-1中,构建pGEX-4T-1／gbpCE原核融合表达载体,转化感受态大肠杆菌DH5α,挑选阳性克隆,酶切及PCR鉴定后,异丙基硫代-β-D-半乳糖苷（Isopropyl-β-D-thiogalactoside,IPTG）诱导表达融合蛋白GST-GbpC^E,SDS-PAGE检测表达产物。结果：测序结果与Sato等报道的序列一致;原核表达后,在SDS-PAGE凝胶上出现一条新生蛋白条带,其相对分子量约43000,与预计大小相符合。结论：成功克隆并表达gbpC特异片段,获得了融合蛋白GST-GbpC^E,为制备GbpC抗体打下了基础。     

组织工程化子宫片层构建的实验研究

目的利用组织工程方法体外构建了与子宫壁内膜和肌层相近的子宫片层。方法将分离培养的兔子宫平滑肌细胞和基质细胞分别与液态Ⅰ型胶原支架材料混合,依次接种于自制静态力学拉伸模具中,再将上皮细胞接种在基质层上,形成组织工程化子宫组织。采用组织学和免疫组织化学方法观察所构建的组织工程化子宫的组织学特征,扫描电镜检测上皮细胞微结构。结果分离培养的兔子宫平滑肌细胞、基质细胞和内膜上皮细胞的纯度均达到95％以上。在静态力学拉伸下培养14天后,在胶原凝胶上生长的平滑肌细胞和基质细胞按拉伸方向有序排列,上皮细胞生长在最上层。激素处理后,扫描电镜观察显示上皮细胞表面有羽状突或纤毛,并且附有大量的微绒毛。结论由平滑肌细胞、基质细胞、上皮细胞和Ⅰ型液态胶原构建,并经静态力学拉伸构建的组织工程化子宫片层能较好地模拟自然子宫的形态结构和功能。     

采用Percoll非连续密度梯度离心法纯化大鼠乳鼠心室肌细胞

目的 探索从心室肌组织中纯化心肌细胞的方法。方法 用胰蛋白酶消化大鼠乳鼠心室肌组织，获得细胞悬液经Percoll分离，通过光镜和免疫组织化学方法对获得的每层细胞进行分析，采用免疫组织化学和激光共聚焦方法鉴定心肌细胞。结果 Percoll分离后，细胞分为6层，每层细胞培养3d时，通过光镜和免疫组织化学观察发现心肌细胞富集在第4、5两层。富集的心肌细胞第3天形成细胞簇或细胞单层，收缩明显而有力。心肌细胞可维持良好的形态和活力达2～3个月。结论 使用Percoll分离法可以从大鼠乳鼠心室肌组织中纯化心肌细胞。     

硒促进小鼠胚胎干细胞分化为胰岛细胞的实验研究

目的：探讨硒在体外诱导小鼠胚胎干细胞向胰岛细胞分化中的促进作用。方法：将ES-D3小鼠胚胎干细胞悬浮培养7d形成拟胚体，然后进行贴壁培养，加入分化培养液1诱导6d，然后用分化培养液2诱导6d。最后用含不同浓度的亚硒酸钠的培养基诱导20d。对诱导后获得的胰岛素产生细胞团(IPCC)细胞进行双硫腙染色，对染色结果进行体视学分析。进行胰岛素刺激释放试验，用ELISA法测定胰岛素释放量。RT-PCR法检测胰腺细胞相关基因的表达。结果：亚硒酸钠浓度在0．03～810μmol／L之间时，经过系列诱导后获得的IPCC其DTZ阳性率随着亚硒酸钠浓度的提高而显著升高。当亚硒酸钠浓度为270μmol/L时DTZ阳性率上升至最高点，随后开始缓慢下降；胰岛素分泌释放试验也证实270μmol/L亚硒酸钠诱导的细胞释放的胰岛素最多。RT-PCR结果进一步表明诱导获得的IPCC具有类胰岛组织的功能。结论：硒对胚胎干细胞向胰岛细胞分化具有促进作用。     

兔膀胱移行上皮种子细胞的培养及扩增

目的 对膀胱移行上皮细胞进行原代及传代培养，探讨用于膀胱组织工程研究的移行上皮种子细胞的培养方法。方法 采用组织块培养法，将获取的移行上皮组织小块在添加附加成分的无血清F12培养基进行培养，观察培养细胞的形态及生长增殖情况，并对传代培养的细胞进行免疫组化染色鉴定。结果 原代移行上皮组织培养约9-10d时细胞可达90％的汇合，传代培养的移行上皮细胞生长稳定期较长，细胞至5—6代时生长状态仍然良好。免疫组化染色显示培养细胞为移行上皮细胞。结论 采用组织块培养法能成功地原代培养兔膀胱移行上皮细胞，在添加附加成分的F12培养基中移行上皮细胞能够稳定地传代培养，表明该法可为膀胱组织工程的研究提供一定数量活性良好的移行上皮细胞。     

人脐带间充质干细胞来源的外泌体促进小鼠成骨前体细胞增殖与分化

 

目的 提取人脐带间充质干细胞(human umbilical cord mesenchymal stem cells, hucMSCs)来源的外泌体(hucMSC-exo),观察其对小鼠成骨前体细胞(mouse osteoblast progenitor cells, mOPCs)的作用。方法 体外分离培养hucMSCs,超速离心法收集外泌体;采用CCK8试剂盒检测不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs增殖的影响,碱性磷酸酶活性检测以及茜素红染色观察不同浓度梯度hucMSC-exo对mOPCs矿化的影响。结果 成功提取hucMSCs,呈现旋涡状贴壁式生长,形态呈长梭形,具有多向诱导分化潜能。HucMSCs来源的外泌体呈圆形、椭圆形,大小在80 nm左右最多,阳性表达CD9,CD63。CCK8法结果显示5、10 μg/ml的hucMSC-exo可以显著地促进mOPCs在体外的增殖(P<0.05),碱性磷酸酶和茜素红染色结果发现5、10 μg/ml的hucMSC-exo组可以明显提高mOPCs碱性磷酸酶活性及钙化结节的形成,且10 μg/ml的外泌体浓度作用强于5 μg/ml,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 成功提取了hucMSCs及hucMSC-exo,hucMSC-exo可以以浓度依赖的方式促进mOPCs的增殖与成骨分化。