大鼠牙髓干细胞的培养和鉴定

目的：分离培养大鼠牙髓干细胞并对其进行生物学鉴定。方法：采用单细胞克隆的方法进行大鼠牙髓干细胞的分离培养,并将达到一定数量级的牙髓干细胞与HA—TCP支架材料进行复合,移植入裸鼠背部皮下,8周后取材进行组织学鉴定。取鉴定成功的细胞株复苏进行细胞生物学特性研究,同时进行成牙本质细胞诱导并进行DsP、DMP1免疫组织化学染色一结果：单细胞来源的细胞克隆(RDPSC282)移植物组织切片可见牙本质牙髓复合体样结构。复苏细胞形态为梭形,细胞密集时形态多样,为卵圆形或多角形,细胞群体倍增时间为58．3h,克隆形成率为1．33％,免疫组化染色DSP、DMPl均为15月性,经矿化液诱导后部分细胞胞浆DsP及DMP1出现阳性染色。结论：首次成功分离培养出一株大鼠牙髓干细胞。     

小鼠骨髓间充质干细胞分离培养新方法

本研究旨在建立一种方便、快捷、有效体外分离培养小鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymalstemcells,MSC）的方法。在无菌条件下取小鼠股骨、胫骨,分别用全骨髓贴壁法、骨片消化法、骨髓加骨片法分离小鼠MSC,比较Msc集落出现时间、大小及数量;应用流式细胞术检测细胞免疫表型,并进行MSC成骨、成脂分化鉴定。结果表明,骨髓加骨片法出现的集落时间最早,集落数量最多,第4天集落数为20±4个;骨片消化法为11．5±2．5个;全骨髓贴壁法最少,为9．5±1．5个;到第3代时,骨髓加骨片法获得细胞数量最多,是全骨髓贴壁法和骨片消化法的2倍;流式细胞术检测结果显示,获得的细胞高表达干细胞标志之一Sca-1,高表达CDdd、CD29,不表达白细胞表面抗原CIM5和内皮细胞标志CD31等;所分离的MSC在成骨诱导体系和成脂诱导体系中能分别向成骨细胞和脂肪细胞分化,具有典型的MSC特性。结论：骨髓加骨片法是一种方便、快捷、有效的小鼠骨髓MSC分离方法。     

IL—1ra对人牙周膜成纤维细胞骨钙素分泌的调节作用

目的：观察白细胞介素1受体拮抗剂（IL－1ra）与IL－1β对人牙周膜成纤维细胞（HPLF）骨钙素分泌的影响。方法：采用骨钙素放射免疫测定法。结果：经IL－1β单独作用的HPLF的骨钙素浓度与对照组相比有显著性差异,一定浓度的IL－1ra与IL－1β共同作用HPLF后,骨钙素浓度比单独IL－1β作用组的低,结论：IL－1ra能竞争性地抑制IL-1β的生物学活性,为进一步临床应用提供理论依据。     

永生化软骨细胞体内软骨形成的实验研究

目的　探讨以永生化软骨细胞作为种子细胞构建和形成软骨的可能性。方法　把人端粒酶逆转录酶基因(hTERT)导入兔髁状突软骨细胞 ,G418筛选 ,挑选阳性克隆扩增培养 ;实验组将扩增培养的转染细胞与细胞支架材料 β 磷酸三钙 ( β TCP)复合 ,对照组将正常软骨细胞与 β TCP复合或单纯 β TCP在体外培育后种植于裸鼠皮下 ,3和 6个月取材进行组织学和免疫化学检测 ,并与对照 1组和对照 2组进行比较。结果　实验组和对照 1组可见复合体包裹软骨样组织 ,对照 2组有少量纤维样组织形成。免疫组化染色显示 ,实验组番红“O”、甲苯胺蓝和Ⅱ型胶原染色呈强阳性 ,有明显软骨组织形成 ,与对照组有显著性差异 (P <0 0 1) ,对照 1组染色呈弱阳性 ,对照 2组则为阴性。结论　永生化软骨细胞可以作为软骨组织工程的种子细胞 ,具有较好的软骨形成能力     

采用组织工程技术建造人工膀胱组织的实验研究

目的　通过将扩增的膀胱种子细胞与一定形状聚合材料复合后植入裸鼠体内进行培育 ,尝试采用组织工程技术建造人造膀胱组织的可行性。方法　从幼兔取膀胱 ,机械分离与酶消化获取上皮细胞和平滑肌细胞 ,在体外培养并扩增细胞 ,之后将上皮细胞和平滑肌细胞分别接种到聚合材料的内外表面 ,将其植入到裸鼠体内进行培育。对植入术后4、8周的标本取材 ,进行大体、组织学观察及免疫组化检测。结果　培育的细胞材料复合体的内壁可形成数层移行上皮细胞层 ,外壁由数层平滑肌细胞层构成。随着聚合材料的降解 ,移行上皮细胞与平滑肌细胞不断增殖并达汇合。结论　采用组织工程技术可再造出类似于正常膀胱壁的人造膀胱组织     

In Vitro Chondrogenic Phenotype Differentiation of Bone Marrow-derived Mesenchymal Stem Cells

In order to study the chondrogenic phenotype differentiation of adult sheep bone marrowderived mesenchymal stem cells (MSCs) in a defined medium as potential seed cells for cartilage tissue engineering, MSCs were isolated by density centrifugation with Percoll solution from bone marrow aspirated from sheep iliac crest. The third passage of MSCS were induced with H-DMEM containing TGF-β3 .IGF-I, Dexamethasone and VitC. The shape and ultrastructure of cells were observed, toluidine blue stain for GAG and immunohistochemistry for type II collagen were applied for chondrogenic phenotype identification. After 14 days of induction, MSCs changed from a spindlelike appearance to a polynal shape, a large amount of endoplasmic reticulum, Golgi complex and mitochondria were observed, and the differentiation of MSCs chondrogenic phenotype was verified by positive staining of toluidine blue and immunohistochemistry. MSCs derived from bone marrow can differentiate to chondrogenic phenotype when induced in vitro and can be used as optimal seed cells for cartilage tissue engineering.     

人骨髓间质干细胞体外扩增和向成骨细胞分化的实验研究

骨髓间质干细胞（mesenchymal stem cell,MSCs）是一类存在于骨髓中的具有多向分化潜能的干细胞，在体外不仅可分化为间质类细胞，而且可以分化为非间质细胞。本研究探讨人骨髓间质干细胞的体外分离纯化、培养扩增和向成骨细胞诱导分化的条件。利用密度为1．073g/ml的Percoll分离骨髓的单个核细胞，以含10％胎牛血清的低糖DMEM培养基培养与扩增MSCs，细胞纯度可达95％左右。取第二代和第三代的MSCs，以含有不同浓度的抗坏血酸、β－磷酸甘油、地塞米松的诱导培养基向成骨细胞诱导，诱导向的细胞呈现典型的成骨细胞样改变，免疫组化技术显示其I型胶原染色阳性，ALP染色阳性，表明MSCs在体外具有向成骨细胞分化的潜力。     

人牙髓细胞与牙龈成纤维细胞差异表达基因的克隆及特征分析

目的批量克隆人牙髓细胞（HDPC）与人牙龈成纤维细胞（HGF）的差异表达基因并对其特征进行分析,研究HDPC的生物学特性。方法体外培养HDPC和HGF,应用基于PCR的改良消减杂交技术构建HDPC和HGF的cDNA消减文库,批量克隆HDPC和HGF的差异表达基因并测序,使用GenBank的BLAST对测序结果进行同源序列比较。结果经过序列测定,获得12个差异表达基因的序列,经BLAST分析有2个为未知基因。在已知基因中,含有4个与细胞信号转导机制相关的基因;2个与细胞转运机制相关的基因（包括细胞膜及细胞核膜转运）;2个与细胞RNA剪接机制相关的基因。结论HDPC的生物学特性是由某些特定基因的差异表达所决定的,其生长、分化机制可能与相对旺盛的蛋白合成及分泌活性相关。