转基因动物技术研究进展

转基因动物技术起始于上个世纪七十年代末,随着生物科学的飞速发展,此技术也得到很大的进步。转基因动物技术在生物医药、农业等领域具有重要的作用。本文就转基因动物技术的发展、方法、应用及面临的问题做一综述。     

自精保存在辅助生殖技术中的意义（附74例分析）

目的探讨自精冷冻保存在辅助生殖技术中的意义。方法对2008年9月至2010年11月期间辅助生殖技术前进行自精冷冻保存病史进行回顾性分析,项目包括自精保存人数,自精保存原因,自精来源,精液复苏情况,自存精液利用率等项目。结果共有74名男性行精液冷冻。21例患者为附睾穿刺获取精子,其余53例患者均为准备接受辅助生殖（ART）治疗者：12例少弱精子症患者,担心女方取卵日无法取到可用精子,5例患者女方取卵日丈夫无法到中心留取精液,36例患者因取精困难,担心取卵当日取精障碍。冷冻精液共复苏29例,其中可用17例,使用率约58.6%。结论自精冷冻保存在辅助生殖技术中有重要的作用,可以在一定程度上避免由于男性取精困难造成的辅助生殖的失败,缩短此部分患者的治疗周期,减少治疗费用。     

成体兔次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶基因的打靶研究

目的构建兔HPRT基因打靶载体。方法在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤一鸟嘌呤磷酸核糖转移酶（Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HGPR乃基因BAC克隆（LBNL1—304M19）的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12．5kb无启动子的HGPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS-HGPRT质粒。然后基于pKS-HGPRT和pEGFP—C1-SD1211质粒,构建了含有绿色荧光蛋白（GFP）及新霉素（neo）筛选标记基因的打靶载体pKS-HGPRT-GFP—neo。结果将线性化的打靶载体通过脂质体转染的方法整合到成体兔成纤维细胞基因组中,利用G418及6-TG进行细胞克隆的抗药物筛选,共得到抗性细胞克隆20个。对细胞克隆进行PCR及测序初步鉴定,获得8个发生同源重组的细胞克隆,还需利用Southern blotting做进一步验证。结论成功快速地构建了且PR丁基因敲除型打靶载体,为下一步进行体细胞核移植制备HGPRT基因敲除转基因克隆兔奠定基础。     

利用PCR产物快速构建兔HPRT 基因无启动子打靶载体

目的 探讨构建兔HPRT基因打靶载体的方法,为下一步获得兔 HPRT基因敲除动物模型和转基因兔奠定基础.方法 首先在已经筛选到含有兔全长次黄嘌呤-鸟嘌呤磷酸核糖转移酶 (Hypoxanthine guanine phosphoribosyl transferase,HPRT)基因BAC克隆(LBNL1-304M19)的基础上,利用Red重组系统,从此克隆上将一段12.5 kb无启动子的HPRT基因组片段克隆到pKS-质粒上,产生pKS-rHPRT质粒.然后基于pKS-rHPRT和pIGCN21质粒,通过PCR的方法获得两个不同的带有50 bp HPRT 基因同源序列的IRES-eGFPCre-Frt/Neo/Frt同源重组片段,最终构建 HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.结果 PCR、限制性内切酶及DNA序列测定,表明载体构建成功.结论 成功快速地构建了HPRT 基因敲除打靶载体和无启动子基因敲入型打靶载体.同时对利用同源重组技术敲除或插入DNA片段的效率进行了研究.     

胚胎形态动力学参数与胚胎整倍性的关系

目的探讨胚胎形态动力学参数与胚胎整倍性之间的关系。方法回顾性分析2016年6月至2019年12月在本中心接受胚胎植入前遗传学检测(PGT)治疗的150名患者的临床资料,共纳入550枚未发生逆分裂、评分在5BC、5CB及以上的可用囊胚。进行滋养层细胞活检后采用单核苷酸多态性(SNP)芯片技术检测胚胎整倍性,并根据囊胚整倍性分为整倍体胚胎组和非整倍体胚胎组。通过时差成像技术(Time-lapse)比较两组14个胚胎早期形态动力学参数[第二极体排出时间(tPB2)、原核出现和消失时间(tPNa和tPNf)、发育至2细胞至8细胞时间(t2、t3、t4、t5、t6、t7、t8)、第二、三个细胞周期间隔时间(cc2和cc3)、第二、三次细胞分裂同步性指标(s2和s3)]及5个晚期形态动力学参数[开始致密化时间(tC)、形成桑椹胚时间(tM)、形成囊胚时间(tSB)、囊胚孵出时间(tHB)]。结果整倍体胚胎的t4[35.81(34.04,37.86) h vs. 36.47(34.14,39.08) h]和s2[0.49(0.25,1.00)h vs. 0.50(0.25,1.25)h]均显著小于非...     

第二极体排出时间在预测体外受精结局中的价值

目的探讨第二极体(PB2)排出时间在预测体外受精结局中的价值。方法选择2010年10~12月在上海瑞金医院生殖医学中心行常规体外受精周期的患者,分别于授精后的3 h、4 h、5 h观察PB2出现情况。根据授精后5 h内是否排出PB2将卵子分为A组(有PB2排出)和B组(无PB2排出);再根据PB2排出时间,将A组的卵子分为A1(3 h排出)、A2(4 h排出)和A3组(5 h排出)。比较各组的受精率、卵裂率和可用胚胎率。结果授精后3 h约29.13%的卵子排出PB2,4 h约59.19%卵子排出PB2,5 h约68.25%卵子排出PB2;A组的受精率、两原核(two pronuclear,2PN)率、卵裂率和胚胎可用率显著高于B组(P<0.05),异常受精率两组比较无统计学差异(P>0.05);A1组的受精率、2PN率、卵裂率、可用胚胎率显著高于A2和A3组,异常受精率显著低于A2和A3组(P<0.05);A2和A3组的受精率、卵裂率和胚胎可用率比较,均无统计学差异(P>0.05)。结论体外受精周期中,根据PB2排出时间预测体外受精结局有一定的价值,但尚存局限性;PB2排出时间与胚胎质量存在一定的关系。     

电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的初步研究

目的采用电穿孔方法,介导质粒载体pEGFP-cl转入兔成体成纤维细胞,探讨建立电穿孔介导外源基因转染兔成体成纤维细胞的基本条件。方法电穿孔介导质粒载体pEGFP—cl转入7．10代兔耳成体成纤维细胞系GG,研究不同电压、电容、DNA剂量,孵育温度的条件下,观察细胞存活数,流式细胞仪测试GFP的含量。结果以PBS作为电击基础液、细胞浓度2×10^6个／ml,电压250V、电容700μF,DNA用量30μg时,兔耳成纤维细胞的转染率和存活率最佳。且电击前冰浴10min,电转染后37℃孵育10min有利于提高细胞的转染率和存活率。结论在合适电压、电容、DNA剂量条件下,电转染提供了外源基因转染兔耳成体成纤维细胞适用性;电转染前的一定时间冰浴和电转染后一定温度孵育可使电转染效率得到改善。     

二甲亚砜和乙二醇对人卵母细胞毒性作用的研究

目的评估在不同温度、时间条件下,二甲亚砜和乙二醇对人GV、MⅠ、未受精MⅡ卵子的毒性。方法收集本中心废弃的GV、MⅠ及未受精MⅡ卵子,并随机分配到A、B及C组。A组：将卵子于不同温度下放入ES中10min或20min。B组：将卵子于不同温度下放入VS中1min或5min;C组为对照组。统计分析卵子的发育潜能。结果A组或B1、B2组中各种卵子的发育潜能没有显著差异（P〉0．05）,而MⅠ卵子的体外成熟率都显著低于C组（P〈0．05）。B3、B4两组中GV卵子的体外成熟率显著低于C组（P〈0．05）。B3组中MⅠ、未受精MⅡ卵子的成活率要显著高于B4组（P〈0．05）。B3、B4两组中MI卵子的体外成熟率、受精率显著低于C组,MⅡ卵子的受精率、囊胚率显著低于C组（P〈0．05）。结论室温或37℃条件下,亚砜和乙二醇混合剂对GV、MⅠ或未受精MⅡ卵子的毒性无明显差异。     

滋养层细胞活检法分析人废弃胚胎源性囊胚发育与染色体异常

目的:探讨年龄、卵裂期胚胎碎片、囊胚生长速率与形态对染色体异常的影响。方法:收集226例患者授精培养后第3日不适于移植和冷冻的正常受精来源的废弃胚胎988枚,激光辅助打孔后,依年龄和胚胎碎片比率分组序贯培养至囊胚期。待第5～7日囊胚形成且滋养外胚层细胞脱出2～9个时活检,同时评估囊胚生长速率与形态;机械法分离活检后存活囊胚的内细胞团细胞,应用13q14.2,21q22.13特异位点探针行FISH检测,分析染色体异常发生情况。结果:FISH检测99枚囊胚,其中58枚(58.6%)存在染色体异常;当患者年龄≥35岁时,其囊胚染色体异常风险增高;尤其胚胎碎片比率>25%者,形成的囊胚形态较差且染色体异常程度复杂(P<0.05)。随囊胚生长速率的延缓与形态分级的降低,染色体异常发生率增高。滋养层细胞活检后囊胚均存活,在分离内细胞团的36枚囊胚中,滋养层与内细胞团细胞的FISH荧光信号吻合率为91.7%。结论:体外受精治疗周期部分废弃胚胎可发育至囊胚,但由于受年龄、胚胎碎片等因素影响,囊胚染色体异常率较高,可能导致胚胎发育延迟且囊胚形态较差;FISH检测囊胚滋养外胚层细胞法可评估胚胎的染色体组成。     

卵巢组织冷冻技术在女性生育力保存中的应用

卵巢是雌性动物的重要生殖器官,富含许多不同发育阶段的卵泡,是一种天然的卵泡池。原始卵泡对冷冻保护剂的耐受性要高于生长卵泡,而卵巢皮质是原始卵泡的聚集地,因此卵巢皮质组织冷冻保存是一种更安全、有效、极具开发潜能的女性生育力保存方式。卵巢组织冷冻可以一次性保存大量的配子。然而,目前卵巢组织冷冻技术还是一个试验性的技术,临床应用面临很多困难和阻碍。本文将从卵巢组织冷冻技术、移植、临床应用及发展方向作一综述。