血管加压素对大鼠肾脏水孔蛋白2表达的影响

背景和目的水孔蛋白2(AQP2)是调节机体水平衡的通道蛋白,与多种具水盐代谢异常疾病的病理发生发展密切相关,本文观察血管加压素(AVP)对 WKY 大鼠肾脏 AQP2表达的影响。方法 WKY 大鼠16只,随机分成2组,一组 AVP[2.5 U/(kg·d)]腹腔注射,等量的生理盐水腹腔注射为对照。7天后处死大鼠,RT-PCR法检测两组大鼠。肾脏 AQP2的 mRNA 表达,免疫组化法检测 AQP2蛋白表达水平,放射免疫法检测大鼠血浆 AVP浓度。结果 AVP 注射组大鼠血浆 AVP 浓度明显升高[(65.7±7.9)vs 对照组(51.2±7.9)pg/mL,P<0.05],肾脏 AQP2 mRNA(0.68±0.14 vs 0.39±0.11,P<0.05)和 AQP2蛋白表达水平(0.71±0.09 vs 0.42±0.12,P<0.05)均显著高于对照组。结论 AVP 可刺激肾脏 AQP2的表达,AQP2可能是 AVP 调节肾脏水代谢的机制之一。提示水通道蛋白2表达的调节可能成为干预某些心血管疾病,如充血性心力衰竭、高血压的靶点。     

心肌肌凝蛋白重链启动子的心血管组织特异性基因表达及其活性

目的探讨心肌肌凝蛋白重链(cMHC)基因启动子的心血管组织特异性及其表达活性,构建心血管组织靶向性表达的基因载体.方法分别采用PCR法合成大鼠cMHC基因启动子片段(-1600～+32)和酶切法获得CMV启动子片段,以取代pAdSV4nlacZ载体中的LTR启动子,获得pAdSV4nlacZ、pAdMHCnlacZ和pAdCMVnlacZ.上述载体分别转染培养的大鼠血管平滑肌细胞(VSMC)、心肌细胞(CM)、心肌成纤维细胞(CF)和人胚肾细胞(293细胞),观察lac Z基因在上述细胞中的表达活性.结果β-半乳糖苷酶活性在pAdSV4nlacZ和pAdCMVnlacZ转染的各组细胞间无显著差异;pAdMHCnlacZ在转染的CM中lac Z基因的表达明显高于其他各组细胞,β-半乳糖苷酶活性在VSMC组低于CM组,高于CF和293细胞(%P%<0.01),在CF和293细胞间无差异(%P%>0.05).结论 cMHC启动子的转录活性相对低于CMV启动子和LTR启动子,而在CM和VSMC中的表达活性高于CF和293细胞,具有良好的心血管组织定向表达能力,适合用于心血管疾病的基因治疗.     

大鼠HSP27基因RNA干扰慢病毒载体的构建与鉴定

目的构建大鼠的热休克蛋白27(heat shock protein27,HSP27)RNA干扰慢病毒载体。方法设计并合成3对互补针对大鼠HSP27 mRNA的oligoDNA片段。磷酸化和退火后,分别克隆入pSUPER-basic质粒载体,获重组的pSU-PER-HSP27-oligoDNA。将其中表达shRNA的结构酶切插入慢病毒转移质粒pNL-IRES2-EGFP,产生pNL-HSP27-IRES2-EGFP,在293T细胞中与VSVG、pHelper包装产生慢病毒。48 h后收集上清液,离心过滤后进行病毒滴度测定。用构建正确的慢病毒质粒载体感染血管平滑肌细胞(vascularsmooth muscle cells,VSMCs),检测干扰效果。结果酶切和测序两种方法结果证明3种质粒载体的插入序列完全正确,慢病毒载体构建成功并获得相应的慢病毒,病毒悬液的滴度为3.12×109fu.L-1。重组慢病毒质粒pNL-HSP27-IRES2-EGFP-1的RNA干扰效率最高,为0.771。结论成功构建靶向大鼠HSP27基因RNAi慢病毒载体。为进一步研究HSP27功能和用慢病毒进行基因治疗奠定基础。     

替米沙坦对同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1、核因子κB表达及细胞黏附的影响

目的观察替米沙坦对同型半胱氨酸诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞血管细胞黏附分子1(VCAM-1)、核因子κB(NF-κB)表达及与单核细胞黏附的影响。方法胶原酶消化法获取人脐静脉内皮细胞;RT-PCR检测VCAM-1 mRMA的表达;Western blot检测VCAM-1、NF-κB蛋白的表达;ROSE BENGAL染色法检测单核细胞-血管内皮细胞黏附功能。结果与空白对照组相比,同型半胱氨酸增强了人脐静脉内皮细胞VCAM-1 mRMA、VCAM-1蛋白、NF-κB p65蛋白的表达水平及与单核细胞黏附能力。替米沙坦(1000 nmol/L组)明显降低了同型半胱氨酸诱导的人脐静脉内皮细胞VCAM-1 mRMA、VCAM-1蛋白、NF-κB p65蛋白及与单核细胞的黏附水平(P<0.01)。与同型半胱氨酸组比,PDTC(NF-κB抑制剂)组NF-κB p65蛋白、VCAM-1 mRMA、VCAM-1蛋白表达水平均明显降低,内皮细胞与单核细胞的黏附水平也明显降低(P<0.01)。结论替米沙坦抑制了VCAM-1 mRMA和蛋白的表达及内皮与单核细胞的黏附水平,其机制可能是通过抑制NF-κB而抑制炎症反应及内皮损伤。     

携带肾上腺髓质素基因腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达

背景:肾上腺髓质素具有促进骨髓间充质干细胞增殖、生长及减少凋亡等作用.目的:观察携带肾上腺髓质素基因的腺病毒体外转染骨髓间充质干细胞及其蛋白的表达.方法:培养293A细胞,并扩增携带肾上腺髓质素基因的腺病毒(Ad-ADM),实验分为对照组、空载体组和Ad-ADM转染组,3组分别于细胞长满至50%~60%时加入等量的无血清L-DMEM、Ad-lacZ和Ad-ADM,噬斑法检测扩增后腺病毒的滴度;贴壁法体外分离、扩增培养大鼠骨髓间充质干细胞;Ad-GFP体外感染骨髓间充质干细胞后检测转染效率;RT-PCR检测Ad-ADM转染后肾上腺髓质素mRNA的表达.结果与结论:病毒扩增后噬斑试验测定Ad-ADM的病毒滴度为1.1×109 pfu/mL.Ad-ADM感染骨髓间充质干细胞后,肾上腺髓质素mRNA的表达明显增加,对照组、空载体组未见ADM mRNA表达;量化结果表明其表达量从第1天开始逐渐增加,第7天达高峰,在11 d时仍可检测其表达.提示腺病毒对骨髓间充质干细胞有较高的转染效率.感染Ad-ADM后,骨髓间充质干细胞可有效表达肾上腺髓质素.     

缺氧诱导因子1α小干扰RNA对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响*

背景：缺氧可以影响骨髓间充质干细胞分泌细胞因子,其机制可能是通过缺氧诱导因子1α起作用的。 目的：观察缺氧诱导因子1α RNA干扰对骨髓间充质干细胞缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因表达的影响。 方法：贴壁法培养骨髓间充质干细胞,取第3~5代细胞用于实验,倒置显微镜下观察细胞形态,并用流式细胞仪检测其表面标志物CD34、CD44、CD90表达。将骨髓间充质干细胞分四组：常氧对照组(无干预因素)、缺氧组(缺氧24 h)、脂质体对照组(转染空载脂质体后缺氧24 h)、RNA干扰组(转染脂质体介导的RNA干扰序列后缺氧24 h)。RT-PCR法检测骨髓间充质干细胞的缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子 mRNA表达水平, ELISA检测骨髓间充质干细胞培养上清缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子蛋白表达水平。 结果与结论：同常氧对照组比较,缺氧组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1 α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达增高(P < 0.05);同脂质体对照组比较,RNA干扰组缺氧诱导因子1α、基质细胞衍生因子1α和血管内皮生长因子基因及蛋白表达降低(P < 0.05)。证实了缺氧条件可以使骨髓间充质干细胞血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达增加,抑制缺氧诱导因子1α的表达可以使血管内皮生长因子和基质细胞衍生因子1α的表达减少,缺氧诱导因子1α很可能是干细胞移植细胞因子分泌的调控因素。     

阿托伐他汀对慢性肾脏病非透析患者合并骨质疏松症的疗效观察

目的 观察阿托伐他汀对慢性肾脏病(CKD)非透析患者合并骨质疏松症的疗效.方法 观察肾小球滤过率(GFR)在30～60 mL/min的CKD 3期患者使用阿托伐他汀后的骨质疏松改变情况.60例CKD 3期患者分为试验组(n=40)和对照组(n=20),试验组又随机分为小剂量阿托伐他汀组(n=20)及中剂量阿托伐他汀组(n=20),分别予以阿托伐他汀10 mg/d及20 mg/d使用6个月,对照组不予以阿托伐他汀治疗.于试验前及试验第3个月末、第6个月末分别测量股骨及腰椎骨密度值(BMD),检测血钙、磷、碱性磷酸酶(ALP)、甲状旁腺激素(iPTH)、肝功能、血脂及肾功能,观测各组指标的变化情况.结果 3组治疗前、治疗3个月及6个月时的BMD值及血钙、磷、ALP、iPTH值比较,差异均无统计学意义(均P＞0.05).小剂量治疗组及中剂量治疗组6个月后血脂较治疗前明显降低(均P＜0.05).结论 在所使用的阿托伐他汀剂量、时间范围内,阿托伐他汀对CKD 3期非透析患者合并骨质疏松无明显的治疗作用.     

氟伐他汀抑制大鼠血管平滑肌细胞迁移的机制

目的:研究氟伐他汀抑制血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)与血小板源性生长因子-BB(PDGF-BB)诱导的大鼠血管平滑肌细胞(VSMCs)迁移的可能机制。方法:采用体外培养大鼠胸主动脉平滑肌细胞;用特异性单克隆磷酸化热休克蛋白27(phospho-HSP27)抗体的Western blotting检测HSP27的活性;用FITC-鬼笔环肽标记F-actin并在激光共聚焦显微镜下观察细胞骨架的形态变化;采用改良的Boyden微孔膜双槽法进行细胞迁移实验。结果:AngⅡ和PDGF-BB呈浓度依赖性诱导VSMCs的HSP27磷酸化,使VSMCs内F-actin数量明显增加,纵向平行排列,形成应力纤维丝,并促进细胞迁移。100μmol/L HSP27阻断剂槲皮素可阻抑AngⅡ、PDGF-BB刺激VSMCs后产生的应力纤维丝形成,对AngⅡ、PDGF-BB诱导的VSMCs迁移的抑制率分别为55.3%和53.6%,P0.01。氟伐他汀抑制AngⅡ和PDGF-BB诱导的HSP27磷酸化,并有量效关系,抑制作用在10-5mol/L时最显著,最大抑制率分别为42.1%和58.5%,P0.01。结论:氟伐他汀可能通过抑制HSP27磷酸化影响VSMCs的迁移。     

脂肪间充质干细胞对野百合碱诱发的肺动脉高压大鼠肺动脉钙离子通道的影响

 目的：探讨脂肪间充质干细胞(adipose tissue-derived mesenchymal stem cells,ADMSCs)移植对野百合碱（monocrotaline,MCT）诱发的肺动脉高压（pulmonary arterial hypertension,PAH）大鼠肺动脉钙离子通道的影响。方法：胶原酶消化法分离培养ADMSCs。雄性SD大鼠24只,分为正常对照组（Ctr组）、PAH组和ADMSCs组,每组8只。右心导管法测定大鼠的平均肺动脉压(MPAP);称重法测右心室肥厚指数（RVHI）;分别用RT-PCR及Western blotting法测定大鼠肺动脉干电压门控性钙离子通道α1c亚基（CaVα1c）肌浆/内质网Ca2+ ATP酶2a（SERCA-2a）、三磷酸肌醇受体1（IP3R-1）、瞬时受体电位通道1（TRPC1）和TRPC6 mRNA和蛋白的表达水平。结果：（1）MCT注射4周后,与Ctr组相比, PAH组大鼠MPAP和RVHI均显著升高（P<0.05）;ADMSCs移植2周后,与PAH组相比,ADMSCs组MPAP和RVHI均明显降低（P<0.05）。（2）与Ctr组相比,PAH组大鼠肺动脉CaVα1c、TRPC1和TRPC6 mRNA及蛋白表达水平均明显增强（P<0.05）,SERCA-2a 和IP3R-1 mRNA及蛋白表达水平均明显降低（P<0.05）;与PAH组相比,ADMSCs组CaVα1c、TRPC1和TRPC6的表达均明显降低（P<0.05）,SERCA-2a 和IP3R-1的表达均明显增强（P<0.05）。结论：ADMSCs能有效地降低MCT诱发的PAH大鼠的肺动脉压力,减轻右心室肥厚。ADMSCs降低肺动脉压力可能与钙离子通道变化有关。