卡托普利与坎地沙坦对1型糖尿病小鼠肺动脉结构及功能的影响

目的:探究血管紧张素转化酶抑制剂卡托普利(CAP)和血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂坎地沙坦(CAD)对链脲佐菌素诱导的1型糖尿病(T1DM)小鼠模型中肺动脉病理形态学、血管张力、舒张功能和氧化应激水平的影响。方法:本研究为实验研究。选用6~8周龄雄性C57BL/6J小鼠,使用简单随机分组法分为T1DM模型组和正常对照(NC)组...     

胰腺干细胞体外诱导分化为胰岛素分泌细胞及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用

背景：有实验证实人和动物起源的胚胎干细胞或成体干细胞可分化为胰岛素分泌细胞，但其分泌胰岛素的功能及对实验性糖尿病的治疗价值尚需要验证。 目的：观察从大鼠的胰腺组织分离纯化干细胞在体外将诱导分化胰岛素分泌细胞后胰岛素mRNA的表达、分泌胰岛素的能力及对1型糖尿病模型鼠的治疗作用。 设计：随机对照观察。 单位：中日友好医院临床医学研究所。 材料：实验于2004-08／2007—12在北京中日友好医院临床医学研究所病理生理研究室完成。选用8—10周龄雄性SD大鼠及雌性裸鼠各10只，均购自北京维通利华实验动物技术有限公司。实验过程中对动物的处置符合动物伦理学标准。尼克酰胺、链脲菌素均为Sigma公司产品，nestin抗体为BD Biosciences产品。大鼠胰岛素放射免疫检测试剂盒购自Linco research。胰岛素抗体及胰高糖素抗体为Santa Cruz产品。 方法：应用nestin结合的免疫磁珠从SD大鼠胰腺导管细胞中分离和纯化干细胞，经体外扩增及诱导分化形成胰岛素分泌细胞。①采用RT-PCR法检测细胞分化过程中胰岛素mRNA的表达。②将干细胞经诱导分化形成的胰岛进行冰冻切片，采用免疫荧光染色观察胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③对干细胞分化胰岛的胰岛素释放功能进行评价，放射免疫法测定上清中胰岛素检测干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素的能力。④鼠按220mg／kg链脲菌素腹腔注射法制备为1型糖尿病模型，造模后随机摸球分为天然胰岛组及干细胞胰岛组，每组5只。将大鼠天然胰岛（SD大鼠分离）及干细胞分化形成的胰岛分别移植于糖尿病裸鼠左肾包膜下，观察移植后鼠尾静脉血糖变化。 主要观察指标：①细胞分化过程胰岛素mRNA表达。②胰岛样结构中胰岛素及胰高糖素阳性细胞表达。③干细胞分化形成的胰岛分泌胰岛素情况。④移植后鼠尾静脉血糖变化。 结果：①RT-PCR检测结果表明胰岛素mRNA的表达随诱导时间延长而明显升高。②免疫荧光染色结果显示胰岛结构的中间存在大量胰岛素阳性细胞，胰高糖素阳性细胞主要分布于胰岛样结构的周边。③干细胞分化的胰岛在高浓度葡萄糖刺激后明显缺乏快速相的胰岛素释放，而是表现细胞外上清中胰岛素浓度的缓慢升高。④天然胰岛组移植后3d使血糖降低到10mmol／L以下，至观察到60d仍维持在正常水平；干细胞胰岛在移植后8d使血糖降低至10mmol／L以下，且在移植35d后血糖逐渐升高并恢复到胰岛移植前的水平。 结论：大鼠胰腺干细胞经体外扩增和诱导分化后可分化胰岛素分泌细胞，但对葡萄糖的刺激没有快速相的胰岛素分泌。将胰岛素分泌细胞移植到1型糖尿病模型裸鼠后可一定程度地改善糖代谢的紊乱。     

糖基化终末产物诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能改变

目的 研究糖基化终末产物(AGEs)诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能的变化及相关机制.方法 SPF级雄性Wistar大鼠20只,7～8周龄,体重260～280 g,分离培养大鼠视网膜内皮细胞,采用免疫荧光染色、流式细胞术和体外形成毛细血管样网络结构的方法进行鉴定.视网膜内皮细胞在AGEs刺激后,用噻唑蓝(MTT)法分析细胞的增殖能力;用膜连蛋白V/碘化丙啶(Annexin V/PI)双染法检测细胞凋亡;采用逆转录聚合酶链反应(RT-PCR)和流式细胞术检测细胞AGEs受体、人蛋白激酶C(PKC)、细胞间黏附分子1(ICAM-1)和诱导型一氧化氮合酶(iNOS)的表达变化.采用t检验进行统计学分析.结果 分离纯化的大鼠视网膜内皮细胞表达血管性血友病因子(vWF)并在人工基膜上形成毛细血管网络结构.AGEs以时间和剂量依赖的方式抑制大鼠视网膜内皮细胞增殖能力,在200 mg/L的AGEs组培养至第5天时细胞增殖能力低于对照组(t=8.9,P＜0.05),7 d和9 d时抑制作用更明显(t值分别为15.7和46.1,均P＜0.01).400 mg/L AGEs组在第3天开始出现细胞增殖减慢(t=12.5,P＜0.05),从第5天开始增殖速度明显低于对照组(t值分别为22.4、41.5和77.7,均P＜0.01).并且AGEs诱导视网膜内皮细胞凋亡.进一步分析发现AGEs上调了大鼠视网膜内皮细胞AGEs受体、PKC、ICAM-1和iNOS的mRNA表达(t值分别为91.8、9.22、16和42,均P＜0.01)和蛋白水平的表达(t值分别为20.2、12.3、7.7和13.9,均P＜0.01).结论 AGEs可能通过上调AGEs受体诱导大鼠视网膜微血管内皮细胞表型和功能的改变.     

人胚胎胰腺组织干细胞的分离鉴定和纯化

分离人胚胎胰腺组织中的胰岛细胞于体外培养,应用免疫细胞化学及RT-PCR的方法对其中的胰腺干细胞进行鉴定,并应用免疫磁珠的方法纯化其中的干细胞。结论是人胚胎胰腺组织中存在一定比例的干细胞,可以作为体外向胰岛素分泌细胞诱导分化的细胞来源。     

同一组织来源的肝癌干细胞分化能力异质性的体外研究

目的通过比较肝癌干细胞的不同单细胞克隆的体外分化能力,分析同一组织来源的肿瘤干细胞分化能力是否具有异质性,以进一步明确肿瘤干细胞的分化特性,为靶向肿瘤干细胞的治疗提供实验依据。方法通过有限稀释法对肝癌干细胞进行单细胞克隆培养,获得的单细胞克隆通过MTT测定比较其增殖能力。然后分别挑选增殖速度较快和较慢的3个克隆,采用RT-PCR方法比较其干细胞标志物表达水平。对干细胞标志表达水平高的3个克隆(A2、A3和B2)进行向成骨、软骨和脂肪方向的诱导分化。采用实时荧光定量PCR方法检测诱导前后成骨、软骨和脂肪标志分子的表达。结果获得的20个单细胞克隆增殖能力不同,并且增殖能力快的克隆表达干细胞标志物CD133、Oct4、c-kit、SCF、nestin比增殖能力慢的克隆强。向成骨方向诱导后,A2、A3和B2克隆I型胶原mRNA表达水平分别升高了(4.71±0.11)、(2.13±0.15)和(3.82±0.3)倍;骨钙素mRNA的表达水平分别升高(8.55±0.18)、(7.02±0.03)和(7.91±0.09)倍,说明A2克隆向成骨细胞分化能力最强。向软骨方向诱导后,B2分化能力最强,软骨标志分子蛋白聚糖和II型胶原的表达分别上调(25.01±0.19)倍和(17.49±0.19)倍,而在A2未发生明显变化,A3只轻微上调。向脂肪方向诱导后,A2、A3和B2克隆脂联素mRNA表达水平分别升高了(6.12±0.15)、(11.45±0.36)和(12.41±1.03)倍,过氧化物酶体增殖物激活受体γmRNA的表达水平分别升高(4.92±0.02)、(9.54±0.18)和(8.96±0.11)倍。结论来源于同一组织的肝癌干细胞在分化能力上具有异质性,这可能是导致肿瘤组织异质性的原因之一,也提示靶向肿瘤干细胞的治疗需要联合用药。     

瘢痕疙瘩成纤维细胞增殖和凋亡的研究

目的探讨瘢痕疙瘩的成纤维细胞的增殖和凋亡状态.方法采用免疫组化和末端脱氧核苷酸转移酶介导的末端标记技术,检测24例瘢痕疙瘩和其周围正常皮肤中成纤维细胞的增殖和凋亡状态.以每10个高倍镜(400倍)视野中成纤维细胞凋亡及PCNA阳性细胞数与总细胞数之比作为凋亡指数和增殖指数,利用配对t检验进行统计学处理.结果 24例瘢痕疙瘩成纤维细胞和对照组平均增殖指数、平均凋亡指数、平均凋亡指数/平均增殖指数,经配对t检验具有高度显著性差别.结论瘢痕疙瘩成纤维细胞的过量增生和凋亡相对减少在瘢痕疙瘩的发生和发展中起着重要作用.     

C肽治疗对糖尿病肾病GK大鼠模型氧化应激的影响

目的研究C肽对糖尿病肾病GK大鼠肾脏病变氧化应激的影响。方法高脂饮食喂养诱发的糖尿病GK大鼠,当持续出现24 h尿蛋白超过300 mg后判断为糖尿病肾病,随机分为C肽治疗组、对照组和胰岛素治疗组,每组5只,均持续治疗16 w并以同龄的正常Wistar大鼠作为正常组。治疗前及治疗后每4 w检测4组大鼠的血糖、24 h尿蛋白及24 h尿白蛋白定量。治疗后,取各组大鼠肾脏,经PAS染色在光镜及电镜下观察大鼠肾脏肾小球病理改变。采用实时定量(RT)-PCR、Western印迹及免疫组织化学法检测肾小球超氧化物歧分酶(SOD)及诱导型一氧化氮合酶(i NOS)的表达。结果治疗后,C肽治疗组24 h尿蛋白和24 h尿白蛋白水平均明显降低(P<0.05),但血糖无明显下降(P>0.05);胰岛素治疗组血糖虽有降低,但24 h尿蛋白和24 h尿白蛋白水平无显著减少(P>0.05)。病理学结果发现,C肽治疗组肾小球硬化减轻,肾小球系膜增生,基底膜厚度和足细胞的形态均有明显改善,而胰岛素治疗组的肾脏病变未见明显好转。RT-PCR、Western印迹和免疫组织化学结果显示,C肽显著下调肾小球i NOS的表达,上调SOD表达(P<0.05);而胰岛素治疗仅轻度下调i NOS,对SOD上调作用不明显。结论 C肽可能通过下调肾小球毛细血管氧化应激水平而改善GK大鼠糖尿病肾脏病变。     

人肝癌微血管内皮细胞黏附分子表达特点及其对外周血单个核细胞黏附和跨内皮迁移的影响

目的:研究人肝癌微血管内皮细胞(human liver cancer microvascular endothelial cell,HLCMVEC)上黏附分子表达的特点及其对免疫细胞黏附和迁移的影响.方法:分离培养HLCMVEC,以人肝窦内皮细胞系(liver sinusoid endothelial cell, LSEC)作为正常对照.通过细胞ELISA方法比较多种黏附分子在两种内皮细胞上的表达.外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell,PBMC)用荧光染料BCECF标记,将其与HLCMVEC或LSEC共培养,随后采用倒置荧光显微镜和连续光谱荧光仪检测PBMC在两种内皮细胞上的黏附和跨内皮迁移能力;此外,共培养前分别预加各种黏附分子的功能抗体,然后分析各种黏附分子在PBMC与肿瘤微血管内皮细胞黏附和迁移中的作用.结果:HLCMVEC表达CD31、CD34和细胞间黏附分子-3(intercellular adhesion molecule-3,ICAM-3)的水平低于LSEC(P＜0.05),表达ICAM-1和血管细胞黏附分子-1(vascular cell adhesion molecule-l,VCAM-1)的水平明显低于正常LSEC(P＜0.01),但表达整合素αvβ3和αvp5明显高于LSEC(P＜0.01).PBMC在HLCMVEC上的黏附和趋化剂诱导下的跨内皮迁移均显著低于LSEC[黏附:(205.5±46.0) vs (330.5±48.4)个,迁移:(49.0±10.6) vs(110.0±19.2)个,均P＜0.01];该黏附和迁移可被ICAM-1、ICAM-3、VCAM-1抗体明显阻断(P＜0.01),抗CD31抗体对黏附阻断不明显但能阻断跨内皮迁移(P＜0.05).结论:HLCMVEC特有的黏附分子表达特点抑制了PBMC的黏附和跨内皮迁移.     

腺苷及腺苷A1受体在小鼠肾小球系膜细胞收缩中的作用

目的:观察腺苷A1受体(A1AR)在小鼠肾小球系膜细胞的表达,探讨腺苷和A1AR是否参与肾小球系膜细胞的收缩。方法:采用分样筛法提取原代小鼠肾小球系膜细胞,CCK8试剂盒检测细胞增殖,免疫荧光染色和Western blot观察A1AR在系膜细胞中的表达,每2min拍照动态观察血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)刺激30min前后细胞面积的变化,对比腺苷、A1AR激动剂、A1AR抑制剂对细胞收缩的影响。结果:腺苷对系膜细胞的增殖无明显影响,A1AR主要表达于小鼠肾小球系膜细胞的胞浆中。腺苷和A1AR激动剂刺激48h后,系膜细胞在接触AngⅡ30min后的收缩反应显著增强,面积变化值分别达到8947±3658pixels和9813±1640pixels,显著大于正常对照组(4268±2131pixels,P<0.05);而使用A1AR抑制剂刺激48h后,系膜细胞的收缩反应有减弱趋势。结论:小鼠系膜细胞存在A1AR表达,腺苷及A1AR是调节系膜细胞收缩的重要机制。     

GLP-1类药物对糖尿病肾病肾脏保护作用的研究进展

糖尿病肾病是糖尿病的常见并发症,对患者健康和生命威胁严重,但目前治疗手段匮乏。GLP-1类药物是近年研发的治疗糖尿病新药,它可促进胰腺β细胞分泌胰岛素,临床用于辅助降糖药物。研究显示除胰岛外,GLP-1受也表达在肾脏,动物实验显示GLP-1对糖尿病肾脏具有明显保护作用,并且这种保护作用与其控制血糖、血压及体重无关,是GLP-1直接作用于肾小球和肾小管起到保护作用。本文针对GLP-1类药物在治疗糖尿病肾病方面的研究进展进行综述。