人骨形成蛋白2，3成熟肽削短／突变体的表达及其诱骨活性

0　引言　骨形成蛋白 [1 ] (bone morphogenetic proteins,BMPs)是属于 TGF-β超家族的成员 ,目前已有 18个 h BMP基因被克隆 .除 BMP- 1外 ,其他 BMPs在胚胎时期骨组织分化发育、成年骨损伤修复、胚胎发育期中胚层的诱导和分化以及神经系统的发育和修复等方面都起着重要作用 [2 - 4 ] ,因而BMPs有十分乐观的临床应用前景 .利用 E.coli表达的不同的长于成熟肽的羧端肽经复性后均具有不同程度诱骨活性 [5 ,6 ] ,但对短于成熟肽的肽段及其氨基酸组成与其生物学活性的关系 ,尚未见报道 .在上述工作的基础上 ,本研究在大肠杆菌中表达削…     

人α防御素融合表达、纯化及生物活性检测

目的:获得大量重组人α防御素(HDα)并检测其活性,为其深入研究提供必要的材料。方法:体外化学合成得到带有羟氨裂解位点编码序列的HDα基因片段,克隆入pBV220-IL-4表达载体构建重组表达载体pBV220-IL-4-HDα。测序正确后将重组质粒转入大肠杆菌DH5α中进行温度诱导表达。经羟氨裂解去除IL-4后,对所得蛋白进行纯化、复性,以SDS-PAGE和生物学活性检测鉴定其特性。结果:经温度诱导后,融合蛋白主要以包涵体的形式表达,表达产物约占菌体总蛋白的20%;羟氨裂解切除IL-4后,所得目的蛋白的纯度约为99.8%。抑菌活性试验和克隆形成试验显示,所得HDα对细菌生长有明显的抑制作用。结论:成功地构建了HDα基因的重组表达质粒,获得稳定表达的工程菌,并建立了复性与纯化技术,为进一步对其进行功能研究与应用奠定了基础。     

基因重组人骨形成蛋白-2对培养骨髓细胞的生物学效应

目的 骨髓是机体重要的造血器官,其中的单个核细胞主要是单核细胞和巨噬细胞,骨髓组织在骨损伤修复过程中也发挥重要的作用,为提高骨形成蛋白（ＢＭＰ）修复骨缺损的能力。方法 本实验观察了基因重组人骨形成蛋白－２（ｒｅｃｏｍｂｉｎａｎｔｈｕｍａｎＢｏｎｅＭｏｒｐｈｏｇｅｎｅｔｉｃＰｒｏｔｅｉｎ－２,ｒｈＢＭＰ２）对培养骨髓细胞生物学活性的影响。结果 低浓度的ｒｈＭＢＰ２）对培养骨髓细胞生物学活性的影响。结     

人牙周膜成纤维细胞与牙龈成纤维细胞差异表达一条新基因的克隆

目的：克隆人牙周膜成纤维细胞（ｐｅｒｉｏｄｏｎｔａｌ ｌｉｇａｍｅｎｔ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ,ＰＤＬＦ）与牙龈成纤维细胞（ｇｉｎｇｉｖａｌ ｆｉｂｒｏｂｌａｓｔ,ＧＦ）差异表达的新基因。方法：采用基于ＰＣＲ和消减杂交的基因克隆技术构建体外培养的人ＰＤＬＦ与ＧＦ差异表达基因的扣除文库,采用酶切和反向杂交的方法筛选目的的克隆,并进行测序和计算机分析。结果：从构建的人ＰＤＬＦ与ＧＦ细胞差异表达基因的扣除     

人骨形态发生蛋白—2真核表达载体的构建

目的 构建人骨形态发生蛋白－2（hBMP-2）真核表达载体,并观察其在真核细胞内表达的可能性。方法 Sal Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切含有hBMP－2全长cDNA的pUC19,回收1.24kb片段,将其连入真核表达载体pcDNA3,构建重组子pcDNA3-hBMP-2。将重组子转化细菌,扩增后提取质粒,分别用Ecor Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切和Xho Ⅰ单酶切后琼脂糖凝胶电泳鉴定。将重组子转染成纤维细胞,G418筛选形成阳性克隆后继续培养4周行细胞原位杂交和免疫组织化学染色。结果 琼脂糖电泳显示：用EcoR Ⅰ和Xba Ⅰ双酶切后可形成两条带,大小分别为1.3kb和5.38kb,而Xbo Ⅰ酶切位点消失,符合物理图谱,表明载体构建成功,转染后G418筛选所获阳性克隆,继续培养4周,的位杂交和免疫组织化学染色,结果表明hBMP-1基因在mRNA水平和蛋白水平均有表达。结论 成功构建hBMP-2真核表达载体,该载体可在真核细胞内表达,为将来骨损伤的基因治疗奠定了一定的实验基础。     

三种抗人TNF-α重组抗体的重折叠

目的 探讨重组抗体蛋白的复性规律。方法 用共溶剂氧化还原、表面活性剂介导、变性剂介导及抗原介导复性四种条件对抗人TNF－α单域抗体、单链抗体GST融合蛋白进行了分离纯化。结果 复性产物的可溶率为10％左右。结论 几种复性方法均可使目的蛋白复性，抗原的诱导和色谱法复性的复性效率较高。     

人BMP II型受体胞外区cDNA细菌表面呈现载体的构建

0　引言　骨形成蛋白 (BMP)受体有 I型和 II型两种 ,属于TGF- β受体超家族成员 ,都具有丝氨酸 /苏氨酸蛋白激酶活性 .人 BMP II型受体 c DNA全长 3871bp,编码 10 39个氨基酸的蛋白 ,包括 12 5个氨基酸的胞外区 [1 ] . TGF-β超家族信号转导的一般模式为 :配体先与 II型受体结合再与 I型受体形成复合物 ,通过受体激酶激活下游信号传导分子 [2 ] .我们用 PCR方法扩增出 h BMPR- II胞外区 c DNA,测序正确后 ,成功将其定向克隆入细菌表面呈现载体 p Lβ2 ,为其表达及研究BMP结合活性等打下基础 .1　材料和方法1.1　材料　 p U …     

人成骨样细胞机械牵拉力敏感基因cDNA扣除文库的构建

目的 :构建人成骨样细胞机械牵拉力敏感基因cDNA扣除文库。方法 :对培养的人成骨样细胞Saos -2进行二维方向上的加载 ,细胞平均变形幅度为 12 % ,牵拉频率为 12次 /min ,加载 12h后提取应力作用后细胞及正常对照组细胞的mRNA ,制备各自的cDNA ,用基于PCR的消减杂交技术构建人成骨样细胞机械牵拉力作用下差异表达基因文库 ,即机械牵拉力敏感基因cDNA扣除文库 ,并进行初步的序列测定。结果 :成功地构建出人成骨样细胞机械牵拉力敏感基因cDNA文库 ,库容量约为 2 0 0 ;初步的测序结果表明文库内的基因多与应力作用下细胞发生的生物学变化有关 ,并成功地得到一个新的基因片段。结论 :用基于PCR的消减杂交技术可以有效构建人成骨细胞样机械牵拉力敏感基因cDNA扣除文库