Nucleofector TM技术在胰腺十二指肠同源基因1转染大鼠骨髓来源巢蛋白阳性细胞中的应用

背景：通过直接转入基因可强化调控骨髓间充质干细胞特异性分化。所以，有效的基因转染技术是髓间充质干细胞可以在组织工程中使用的关键。 目的：选择Nucleofector^TM技术转染大鼠骨髓间充质干细胞的优化转染方案，为高效体外转染大鼠髓间充质干细胞提供一个新方法。 设计、时间及地点：对比观察细胞基因工程实验，于2007—10／12在南方医科大学珠江医院神经外科实验室完成。 材料：骨髓间充质干细胞来源于SD大鼠，三四周龄，清洁级，体质量60—70g。实验过程：采用密度梯度离心法分离培养大鼠骨髓间充质干细胞，采用全骨髓法＋神经干细胞培养基获得巢蛋白阳性细胞。运用Nucleofector^TM技术的A33及A31程序，分别用1，5，10μg重组质粒pEGFP—C1转染骨髓间充质干细胞及巢蛋白阳性细胞，并将转染后的细胞分别培养在含体积分数为0．10及体积分数为0．20胎牛血清的培养基中。 主要观察指标：①通过LeicaDMIRE荧光显微镜下观察和计数表达绿色荧光的细胞计数转染率。②台盼蓝排斥实验检测细胞活力。③用RT-PCR法分析胰腺十二指肠同源基因1基因在转染细胞中的表达。 结果：应用Nucleofector^TM技术的A33程序转染神经干细胞较转染骨髓间充质干细胞的转染率高，并优于A31程序。转染后在含体积分数为0．20胎牛血清中培养的细胞24h转染率及存活率均显著高于在含体积分数为0．10胎牛血清培养的细胞（P〈0．05）。RT-PCR检测转染重组质粒的巢蛋白阳性细胞中可见胰腺十二指肠同源基因1的mRNA表达，未转染胰腺十二指肠同源基因1的巢蛋白阳性细胞无胰腺十二指肠同源基因1的mRNA表达。 结论：运用Nucleofector^TM技术的A33程序以5μg的DNA转染骨髓来源的巢蛋白阳性细胞，转染后的细胞接种于含体积分数为0．20胎牛血清的培养基中可获得较高的转染效率及较高的存活率。     

人骨髓来源多能成体祖细胞与人肝细胞体外直接共培养向肝样细胞分化的实验研究

目的 探索人骨髓来源多能成体祖细胞(ZHJ-MAPCs)在与人肝细胞系L02在体外共培养条件下诱导分化为肝细胞的可行性.方法 直接共培养:将CFSE荧光(绿色)标记的ZHJ-MAPSs与L02(密度均为1×104/ml)按照各50%比例混合行直接共培养.5 d后用SABC-Cy3免疫荧光(红色)双标后在激光共聚焦显微镜下分别观察ZHJ-MAPCs表达ALB,AFP,CK-18的情况.并设阳性对照(单独培养的L02细胞)和阴性对照(单独培养未经诱导的ZHJ-MAPCs).结果 在共培养第5天检测ALB和CKl8时出现较多胞浆内呈黄色荧光的阳性细胞即向肝细胞分化的ZHJ-MAPCs,而在检测AFP时阳性细胞较少.结论 ZHJ-MAPCs与人肝细胞系L02行直接共培养能够诱导其向成熟肝样细胞定向分化.     

经脐单孔腹腔镜技术用于肝脏恶性肿瘤手术的体会(附2例报告)

目的:探讨经脐单孔腹腔镜手术治疗肝脏恶性肿瘤的可行性及临床应用前景。方法:回顾分析2010年3月至2011年5月为2例患者施行单孔腹腔镜右肝恶性肿瘤切除术的手术方法及临床效果。结果:2例均成功完成单孔手术,无一例中转开腹或增加切口。手术时间分别为75 min和89 min,术中出血60 ml和50 ml,切除肿瘤直径分别为3.5 cm与3.6 cm,术后病理检查结果与术前诊断一致,肿块切缘未见癌细胞浸润。术后无感染、腹腔积液及胆漏等并发症发生,术后1周内出院。结论:单孔腹腔镜右肝恶性肿瘤切除术安全、可行,但术者需同时具备单孔腹腔镜手术及传统腹腔镜肝脏手术的操作经验。相信随着器械的改进,此项技术有望进一步推广应用。     

人骨髓间充质干细胞在大鼠体内转化为肝样细胞的实验研究

目的 探讨诱导人骨髓间充质细胞在大鼠肝损伤模型中转分化为肝样细胞的可能性。方法 建立肝叶切除和亚致死量照射两种肝脏损伤模型,植入人间充质干细胞,检测大鼠谷丙转氨酶、总胆红素和凝血酶原时间的变化;聚合酶链反应检测大鼠肝脏内人特异性DNA序列Alu-sx。结果 造模后行干细胞移植组大鼠肝功能均有明显改善。聚合酶链反应显示各干细胞移植组大鼠肝脏中均能同时检测人特异性DNA序列Alu sx和大鼠特异性DNA序列Sox11。结论 人骨髓间充质干细胞能在肝损伤大鼠肝脏内存活,表达人特异性抗原,并能在肝损伤大鼠肝脏内分化为具有肝功能的肝样细胞,有助于肝损伤大鼠肝功能恢复。     

腹腔镜在胃肠外科的应用

自1987年法国医师Mouret首次完成腹腔镜胆囊切除术以来,腹腔镜技术在世界范围内广泛普及并形成一门新的学科-腹腔镜外科学.腹腔镜是集电学、光学等高科技为一体的一门新的技术,最初用于胆囊的切除,随着对腹腔镜认识的提高、技术的改进、设备及器械的更新,目前已广泛应用于普通外科的每个领域.本文就腹腔镜在胃肠外科的应用作一概述.     

海藻糖对生物人工肝用人永生化肝细胞系C3A细胞低温保存的实验研究

背景：随着生物人工肝在临床上的应用,需要有一种方便、有效、实用的保护生物反应器装载细胞活力及功能的方法,设计有自主知识产权的生物人工肝用肝细胞的低温保护液迫在眉梢。 目的：验证海藻糖作为低温保护剂在4℃低温保存肝细胞的作用。 方法：采用C3A人永生化肝细胞系在不同低温保存液(DMEM培养液;乳酸钠林格氏液,加有不同浓度海藻糖的乳酸钠林格氏液;UW液) 4℃保存24h、48h 及72h。复苏后行细胞活力、细胞损伤指标、氧自由基代谢相关指标等检测,并通过荧光双染法观察细胞凋亡情况。 结果：不同低温保存液保存不同时间的C3A细胞的活力、细胞损伤及细胞凋亡表现均有所不同,其中在同时间点不同浓度海藻糖组均优于单用乳酸钠林格氏液组,但不如UW液组（P<0.01） 。而保存24h的不同浓度海藻糖组及UW液组与乳酸钠林格氏液组相比无显著性差异（P>0.05）,结论：海藻糖能有效减轻低温对肝细胞凋亡及缺血再灌注损伤的程度,因此,可成为低温保存液中有效及重要的保护剂组分。     

新型免疫状态定量监测皮肤移植模型小鼠的特异性

背景：器官移植后如何监测受者的免疫状态,并预测排斥反应的发生,从而调整免疫抑制剂的用量是当前面临的重要问题。目的：探索新型免疫状态定量监测方法在小鼠皮肤移植模型中是否有抗原特异性。方法：建立C57→BALB/c皮肤移植排斥模型,分别输注C57/BALB/c混合脾细胞悬液及第三者对照DBA/BALB/c混合脾细胞,在细胞输注后检测2种混合细胞悬液比例变化及供体细胞杀伤率,同时设置BALB/c→BALB/c同系皮肤移植对照组,免疫低下裸鼠对照组及免疫抑制剂对照组与之对比。结果与结论：C57/BALB/c悬液-移植排斥模型组和C57/BALB/c悬液-移植排斥模型免疫抑制剂组小鼠对供体C57脾细胞有强烈的特异性杀伤作用,其中C57/BALB/c悬液-移植排斥模型免疫抑制剂组特异性杀伤作用稍弱,而输注第三者对照DBA/BALB/c混合脾细胞的小鼠细胞注射2～4h内没有明显特异杀伤作用,但免疫低下的裸鼠始终未表现出特异性杀伤。说明实验建立的抗原特异性免疫状态检测方法能够快速地检测出皮肤移植受体的免疫状态。     

海藻糖对生物人工肝用人永生化肝细胞系C3A细胞低温的保存

背景：随着生物人工肝在临床上的应用,需要有一种方便、有效、实用的保护生物反应器装载细胞活力及功能的方法,设计有自主知识产权的生物人工肝用肝细胞的低温保护液迫在眉梢。目的：验证海藻糖作为低温保护剂在4℃低温保存肝细胞的作用。方法：采用C3A人永生化肝细胞系在不同低温保存液（DMEM培养液,乳酸钠林格氏液,加有不同浓度海藻糖的乳酸钠林格氏液,UW液）4℃保存24,48,72h。复苏后行细胞活力、细胞损伤指标、氧自由基代谢相关指标等检测,并通过荧光双染法观察细胞凋亡情况。结果与结论：不同低温保存液保存不同时间C3A细胞的活力、细胞损伤及细胞凋亡表现均有所不同,其中同时间点不同浓度海藻糖组均优于单用乳酸钠林格氏液组,但不如UW液组（P〈0.01）。而保存24h的不同浓度海藻糖组及UW液组与乳酸钠林格氏液组相比差异无显著性意义（P〉0.05）,提示海藻糖能有效减轻低温对肝细胞凋亡及缺血再灌注损伤的程度,可成为低温保存液中有效及重要的保护剂组分。     

肝脏原发性鳞状细胞癌一例

1.临床资料:病人,男,48岁,已婚,于6年前无明显透因出现右上腹绞痛,呈持续性,阵发性加剧,放射至腰背部,伴发热、寒战、冷汗,无皮肤巩膜黄染,在当地医院治疗后好转,具体治疗不详.     

新西兰雌-雄兔皮肤移植模型体内细胞毒性实验

背景:建立一种有效的评估模式来监测移植后受者免疫状态是当前的难点.目的:建立兔体内细胞毒性实验方法,验证体内细胞毒性实验能否检测出受体的免疫排斥状况.方法:建立新西兰白兔雌-雄兔皮肤移植模型,另设未作移植的雌、雄兔为对照组.取雌兔及雄兔脾脏制备脾细胞单细胞悬液,分别用不同浓度活细胞染料羟基荧光素乙酰乙酸琥珀酰亚胺酯染色后制备1∶1混合细胞悬液.雄兔输注混合细胞后分别于1,2,4,8 h 抽取外周血,流式细胞仪检测外周血两种荧光细胞的比例变化,计算供体特异性细胞杀伤率.结果与结论:雌-雄兔皮肤移植排斥模型在皮肤移植2周后可建立,混合细胞悬液输注后在模型组和对照组外周血中的比例变化不同,雄兔输注混合细胞后1,2,4,8 h的杀伤率模型组高于对照组,差异有显著性意义(P < 0.01).提示体内细胞毒性实验可用于免疫状态监测,可以直观地反映皮肤移植模型的体内特异性免疫环境及移植物所受的免疫攻击强度.