应用胶体金免疫层析技术建立炭疽杆菌芽孢的快速检测方法

〔目的〕　建立 1种炭疽杆菌芽孢的快速检测方法。〔方法〕　利用胶体金免疫层析技术 ,采用双抗体夹心法检测炭疽芽孢杆菌 ,对该方法进行特异性、敏感性等评价 ;在面粉、淀粉、奶粉等材料中掺入炭疽疫苗株芽孢模拟“白色粉末” ,评价该法检测炭疽生物恐怖和环境样品的可行性。〔结果〕　该法能在 2 0min内完成检测 ,多种不同的芽孢菌及其它菌检测评价显示该法特异性良好 ,检测灵敏性为 1× 10 6cfu/ml,环境样品的检测敏感性也相同。〔结论〕　建立的检测炭疽芽孢杆菌的胶体金免疫层析方法 ,能快速、特异、灵敏的检测炭疽芽孢 ,适用于现场的快速检测。     

2种免疫层析技术用于4种传染病及其病原体检测的研究

[目的]寻求能够快速定性,定量检测4种传染病及其病原体的试验方法。[方法]应用双抗体夹心法,建立胶体金免疫层析法、上转磷光(UCP)免疫层析法检测炭疽杆菌芽孢(以下简称炭疽芽孢)、鼠疫杆菌、肠出血性大肠埃希菌O_(157)：H_7(以下简称EHEC O_(157)),评价方法的灵敏性、特异性。通过分别检测模拟掺入3种菌/芽孢的“白色粉末”和检测3种细菌的强毒株,评价在实际环境样品检测中的应用。应用双抗原夹心法,建立胶体金免疫层析法、上转磷光(UCP)免疫层析法检测鼠疫F1抗体、SARS病毒抗体,检测239份青海鼠疫疫区人员血清、1236份新疆鼠疫疫源地鼠血清,检测18份恢复期SARS病人血清和9份健康对照者血清,以及206份出入境健康人员血清,考核2种检测抗体的方法在实际样品检测中的应用。通过比较炭疽杆菌、鼠疫杆菌、大肠埃希菌O_(157)以及鼠疫杆菌抗体、SARS病毒抗体的胶体金免疫层析方法、UCP免疫层析方法,比较我们建立的2套系统与加拿大RAMP系统检测炭疽杆菌的能力。[结果]UCP免疫层析方法能在35min内完成检测,炭疽芽孢检测掺入“白色粉末”的样品灵敏性为1×10~4cfu/ test,炭疽芽孢最低检测限为1×10~5cfu/ml(原溶液芽孢浓度),多种不同的芽孢菌及其它细菌共38种54株检测说明该法特异性良好,仅与腊样芽孢杆菌有交叉反应,特异性为97％；鼠疫杆菌检测灵敏性为5×10~4cfu/ml,最低检测菌数为5×10~3cfu/test,在10~7cfu/ml水平上未发现与30余种细菌有交叉反应,包括最近缘假结核耶尔森菌；EHEC O_(157)检测灵敏性为1×10~3cfu/ml,仅与弗氏枸橼酸杆菌有交叉反应,特异性为98％。胶体金免疫层析方法能在10min内完成检测,炭疽芽孢、鼠疫杆菌、EHEC O_(157)检测灵敏度分别为1×10~6cfu/ml、1×10~5cfu/ml、1×10~5cfu/ml,“白色粉末”等环境样品最低可检测敏感性为1×10~5cfu,1×10~4cfu,1×10~4cfu/test。胶体金免疫层析方法分别应用于炭疽、鼠疫强毒株的检测,检测限为5×10~4cfu/test和7×10~4cfu/test。在实际血清样品检测中,与间接血凝方法对比,鼠疫抗体UCP和胶体金免疫层析方法有更好的敏感性。血清样品检测显示,SARS抗体的胶体金和UCP免疫层析方法均有较好的特异性和敏感性。[结论]2种免疫层析方法都有快速、敏感、特异的特点：上转磷光免疫层析方法可实现定量检测,敏感性优于胶体金免疫层析法；炭疽检测与加拿大RAMP检测系统相当；胶体金免疫层析法具有简便、直观、易行的特点。2种免疫层析方法均适合于炭疽芽孢芽孢、鼠疫杆菌、EHEC O_(157)、鼠疫杆菌抗体、SARS抗体的现场检测和筛查。     

麻疹病毒IgM抗体胶体金免疫层析法的建立

目的 建立检测麻疹病毒IgM抗体的胶体金免疫层析法.方法 用胶体金偶联重组麻疹病毒核蛋白,羊抗人IgM抗体为检测线包被蛋白,通过优化反应条件,建立麻疹病毒IgM抗体胶体金免疫层析法.选取10份麻疹病毒IgM阳性血清和20份健康人血清样本,验证方法的符合率.结果 建立的胶体金免疫层析方法检测阳性血清和健康人血清样本的符合...     

人冠状病毒HCoV-HKU1环介导等温扩增检测技术的研究

目的建立一种快速、灵敏、高效的人冠状病毒HKU1(HCoV-HKU1)LAMP扩增检测方法。方法应用生物信息学软件设计5套LAMP扩增引物,以合成的HCoV-HKU1质粒为模板,通过实时浊度法进行最佳引物组的筛选,并分析该方法的特异性和灵敏度。结果 HCoV-HKU1 LAMP扩增方法针对其他病原微生物及人类基因组无反应信号。该方法可以检测到1拷贝/μl的HCoV-HKU1质粒。结论 HCoV-HKU1 LAMP扩增方法特异性好、灵敏度高,在临床鉴别诊断和口岸冠状病毒的检测中具有很好的应用前景。     

2009年中俄满洲里—后贝加尔斯克口岸地区鼠类及其携带病原的调查研究

〔目的〕了解中俄满洲里—后贝加尔斯克口岸地区鼠类及其携带病原情况。〔方法〕2009年8月,在满洲里和后贝加尔口岸地区采用夹日法和夹夜法捕鼠。采集满洲里地区鼠类脏器和血样本,用聚合酶链反应PCR方法检测肝、脾组织中的鼠疫耶氏菌、土拉弗氏菌和莫氏立克次体核酸;用逆转录RT-PCR方法检测肺组织的汉坦病毒核酸;分别用酶链免疫吸附试验(ELISA)和胶体金免疫层析方法检测血标本中的汉坦病毒和鼠疫耶氏菌、土拉弗氏菌、莫氏立克次体抗体。〔结果〕2009年8月,在中方满洲里口岸地区捕鼠7种53只,总捕鼠率6.63%,优势鼠种为长爪沙鼠、达乌尔黄鼠、黑线毛足鼠;在俄方后贝加尔斯克口岸地区捕鼠10种158只,总捕鼠率19.75%,狭颅田鼠、黑线仓鼠和黑线毛足鼠为优势鼠种。满洲里口岸鼠脏器样本中未检测到病原核酸,血标本中3份汉坦病毒抗体阳性。〔结论〕中俄满洲里-后贝加尔斯克口岸地区鼠类构成不同,中方鼠类中存在汉坦病毒感染。     

Nonidet P-40致流感病毒脱包膜的AFM观察研究

目的 利用原子力显微镜(AFM)观察经非离子表面活性剂Nonidet P-40(NP-40)不同浓度系列处理的A型流感病毒表面形态变化,观察不同表面活性剂-病毒表面相互作用情况,以提供一种较为温和的病毒表面裂解条件,为利用AFM进一步研究病毒下层结构提供基础.方法 用不同浓度的非离子犁表面活性剂NP-40对完整的A型流感病毒进行处理,以轻敲模式经AFM成像,获得病毒球状体和丝状体的高度图、振幅图以及相位图,并观察和比较不同浓度非离子表面活性剂对病毒表面形态和结构的影响.结果 NP-40各浓度对病度表面破坏程度不一,病毒随NP-40浓度增高而逐渐降解,并出现部分剥离病毒表面.暴露下层衣壳,更清晰地展示包膜下层表面突起的表面形态学结果.结论 通过表面活性剂优化处理病毒颗粒,实现了利用AFM观测流感病毒包膜下形态结构的设想.     

麻疹病毒CC-47株非编码区核苷酸序列测定与比较

目的 测定麻疹病毒疫苗株长－47（CC－47）的非编码区核苷酸序列,并和其他麻疹病毒比较,为利用疫苗株病毒进一步研究奠定基础。方法 用RT－PCR分段扩增并克隆麻病毒CC－47株基因组全序列,用基因特异引物测定非编码区的核苷酸序列。结果 CC－47疫苗株非编码区在基因级上为7个不连续的片段,总计1791个核苷酸。与其他野毒株及Edmonston衍生5株疫苗株非编码区序列比较发现,CC－47疫苗株具有Edmonston凤苗株系列相同的4个特殊性的核苷酸替代位点,分别位于基因组3′末端第26位（U→A）、42位（U→G）和M／F基因间隔区FmRNA5′非翻译区的4978位（A→G）、5349位（A→G）,这些位点的改变可能会影响病毒mRNA的合成、加工和翻译次效率以及基因组的复制和包装。结论 不同基因型麻疹病毒具有同样的位点改变可能与病毒在半许可细胞中适应或减毒有关,多区域的核苷酸改变参与病毒的减毒过程。     

狂犬病病毒CTN-1v株原子力显微镜观察结果的初步分析

目的 利用原子力显微镜对狂犬病病毒进行观察.方法 超速离心制备狂犬病病毒CTN-1v株,采用磷钨酸负染透射电子显微镜进行观察,在此基础上进行原子力显微镜观察,采用轻敲模式在大气常温下扫描成像.结果 透射电子显微镜观察到狂犬病病毒的典型弹状病毒粒子,透射电镜提供病毒二维图像,可见刺突结构,原子力显微镜则呈现了狂犬病病毒三维图像,且可见病毒表面有凹凸不平的特征和边缘有齿轮状的突起,同时获得表面粗糙度等可以量化指标.两种方法最终得到相似的形态学结果.结论 利用原子力显微镜首次观察到狂犬病病毒的三维形态结构,与透射电镜观察相比,原子力显微镜是一种制样简单、观察直观的新型病毒形态学研究工具.

Abstract：

Objective To explore the application of atomic force microscopy( AFM ) on the research of morphology of the rabies viruses. Methods To prepare the rabies virus CTN-1v strains by ultracentrifugation, and observe it with transmission electron microscopy (TEM) which negatively stained by phosphotungstic acid. Then study the morphology of rabies virus with AFM based on the result of TEM. AFM image applies the tapping mode to rabies virus without any further treatment in air at room temperature. Results The TEM image is two-dimensional image which can be seen the classical bullet-shaped structure,and the spike structure can also be seen. The AFM image showed the rabies virus morphology with three-dimensional image which can shows the characteristics of the virus surface and edge. The rabies virus particle was successfully observed by TEM or AFM methods. Conclusion It's the first time to get the three-dimensional morphological structure of rabies virus by atomic force microscopy, compared with transmission electron microscopy, AFM is a new research tool for viral morphology study with the advantages of simple sample preparing and intuitionistic and visible interface for researchers.     

通用型基因悬浮芯片检测生物恐怖细菌的方法研究

Objective To develop a fast, high-throughput screening method with suspension array technique for simultaneous detection of biothreat bacteria. Methods 16 S rDNA universal primers for Bacillus anthracis, Francisella tularensis, Yersinia pestis, Brucella spp. and Burkholderia pseudomallei were selected to amplify corresponding regions and the genus-specific or species-specific probes were designed. After amplification of chromosomal DNA by 16 S rDNA primers 341A and 519B,the PCR products were detected by suspension array technique. The sensitivity, specificity, reproducibility and detection power were also analyzed. Results After PCR amplification by 16 S rDNA primers and specific probe hybridization,the target microorganisms could be identified at genus level, cross reaction was recognized in the same genus. The detection sensitivity of the assay was 1.5 pg/μl (Burkholderia pseudomallei),20 pg/μl (Brucella spp.), 7 pg/μl (Bacillus anthracis), 0.1 pg/μ1 (Francisella tularensis), and 1.1 pg/μl (Yersinia pestis),respectively. The coefficient of variation for 15 test of different probes was ranged from 5.18% to 17.88%,it showed good reproducibility. The assay could correctly identify Bacillus anthracis and Yersinia pestis strains in simulated white powder samples. Conclusion The suspension array technique could be served as an opening screening method for biothreat bacteria rapid detection.     

检测土拉弗朗西斯菌的生物素—亲和素ELISA法的建立

〔目的〕建立一种快速、敏感、特异检测土拉弗朗西斯菌的免疫学方法。〔方法〕应用生物素-亲和素标记系统,建立双抗体夹心ELISA方法,检测土拉弗朗西斯菌,并进行"模拟样品"的检测判定其定量检测能力。〔结果〕建立的生物素—亲和素ELISA检测土拉弗朗西斯菌的方法具有很好的敏感性和特异性,检测FopA蛋白的灵敏度达到6ng/ml;批内变异系数1.96%～6.64%,批间变异系数8.94%～10.02%,重复性好;检测不同浓度马秋波GP2蛋白、天花M1R蛋白、黄热YF-E-D3蛋白、禽流感NP蛋白、登革病毒Deng-E-D3蛋白和普氏立克次体120N蛋白,未发现交叉反应;对"模拟样品"中土拉弗朗西斯菌FopA蛋白的检测回收率为91.7%～125.0%。〔结论〕应用生物化的FopA多抗与酶标亲合素结合,建立了检测土拉弗朗西斯菌的生物素—亲和素放大酶联免疫吸附法(BSA-ELISA),具有较好的灵敏度和特异性,在病原菌的识别、快速检测、应对生物恐怖威胁中具有广阔的应用前景。