小鼠RelB基因siRNA慢病毒载体的构建及鉴定

默效率.用pVSVG,plp1,plp2慢病毒包装系统质粒在磷酸钙介导下共转染包装细胞293T细胞,包装产生慢病毒,以293T细胞GFP蛋白的表达水平测定病毒滴度.结果 聚合酶链反应(PCR)和测序证实,成功构建RelB-shRNA的慢病毒载体pLentiLox-sh-RelB.Western blot鉴定最有效的siRNA序列为5'-TGTGGTCAGGcATCTGCTTG-3',病毒液过滤后测定滴度为8×1010 pfu/L.结论 成功构建小鼠RelB基因RNAi慢病毒载体.     

臭氧氧化预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤致细胞凋亡的影响

目的 观察臭氧氧化预处理对大鼠肾脏缺血再灌注损伤导致的细胞凋亡的影响.方法 分为3组进行实验:(1)假手术组:切除大鼠右肾,缝合腹壁;(2)缺血再灌注组:切除大鼠右肾后,夹闭左肾动、静脉45 min,然后开放;(3)臭氧氧化预处理组:手术步骤与缺血再灌注组相同,在术前15d开始经直肠吹入氧气和臭氧的混合气体5～5.5 ml(臭氧浓度为50 mg/L,1 mg·kg-1 ·d-1),应用至术前1d.全自动生化分析仪检测3组大鼠血清尿素氮和肌酐,比色法测定血清脂质过氧化产物丙二醛(MDA)和超氧化物歧化酶(SOD).免疫组织化学法检测大鼠肾细胞胞浆细胞色素C(CytC)的表达,蛋白质印迹法检测CytC的含量.逆转录聚合酶链反应法检测肿瘤坏死因子α(TNF-α)、白细胞介素-1β(IL-1β)和白细胞介素-6 (IL-6) mRNA的表达.结果 缺血再灌注和臭氧氧化预处理组血清尿素氮、肌酐和MDA均高于假手术组,而缺血再灌注组的尿素氮、肌酐和MDA又高于臭氧氧化预处理组.缺血再灌注组血清SOD低于假手术组和臭氧氧化预处理组(P＜0.05).臭氧氧化预处理组的肾组织病理学改变较缺血再灌注组轻.假手术组、缺血再灌注组和臭氧氧化预处理组的CytC表达灰度值分别为101.50±18.02、181.00±20.85和156.71±16.82,两两比较,差异均有统计学意义(P＜0.05).臭氧氧化预处理组肾细胞胞浆和线粒体中CytC含量较缺血再灌注组有所下降(P＜0.05).结论 臭氧氧化预处理可以减轻肾脏脂质过氧化反应,减少炎症因子的合成,抑制CytC的释放,减轻肾缺血再灌注损伤.     

4-1BBL基因修饰前列腺癌细胞的体内抗肿瘤作用

目的 观察转染4-1BBL的小鼠前列腺癌细胞株RM-1体内抗肿瘤效应及对免疫功能的影响.方法 用脂质体法将重组质粒pcDNA3和pcDNA3-4-1BBL分别导入小鼠前列腺癌细胞RM-1中,经G418筛选,建立高表达的细胞株.逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)和间接免疫荧光法检测4-1BBL的表达.将转染前后的肿瘤细胞,分别接种于C57BL/6小鼠的左肋腹侧皮下观察其致瘤性.CCK-8检测其细胞毒性T淋巴细胞(CTL)杀伤活性.结果 成功建立高表达4-1BBL的RM-1/4-1BBL细胞株.25 d后,RM-1/4-1BBL组小鼠致瘤体积为(730.0±23.6)mm3较RM-1/pcDNA3组(1490.0±36.4)mm3和RM-1组(1510.0±26.8)mm3均小(P＜0.05).接种RM-1/4-1BBL细胞小鼠的CTL细胞杀伤活性为(35.4±1.6)%,较RM-1/pcDNA3组(12.8土2.0)%和RM-1组(13.7±3.6)%均增强(P＜0.05).结论 4-1BBL基因修饰的小鼠前列腺癌细胞能显著增强小鼠的免疫功能,抑制肿瘤的发展.     

转染4-1BBL的前列腺癌细胞瘤苗体外诱导抗肿瘤免疫作用

目的:观察转染4-1BBL重组腺病毒载体的小鼠前列腺癌细胞瘤苗体外诱导抗肿瘤免疫作用及机制。方法:利用复制缺陷型腺病毒AdEasy-1系统,通过基因重组技术构建Ad-m4-1BBL及Ad-eGFP。将Ad-m4-1BBL和Ad-eGFP感染小鼠前列腺癌细胞RM-1,以丝裂霉素C(MMC)处理,制成肿瘤细胞疫苗(TCV,TCV-Ad-eG-FP,TCV-Ad-m4-1BBL),经体外与同系小鼠脾淋巴细胞共同培养,ELISA法检测脾细胞分泌细胞因子(IL-2,INF-γ)的影响,CCK-8试剂检测脾淋巴细胞特异性杀伤活性。结果:转染4-1BBL基因的小鼠前列腺癌细胞瘤苗TCV-Ad-m4-1BBL高表达4-1BBL蛋白,培养上清中细胞因子IL-2[(180.24±2.22)pg/ml]和INF-γ[(1 512.46±23.64)pg/ml]表达水平均明显高于TCV和TCV-Ad-eGFP组(P<0.05),TCV-Ad-m4-1BBL瘤苗诱导RM-1细胞特异性杀伤率[(34.24±2.64)%],相比TCV-Ad-eGFP[(14.65±3.21)%]和TCV[(9.82±1.48)%],差异有显著性(P<0.05)。但针对Hepal-6细胞,3种瘤苗均无效。结论:表达4-1BBL的小鼠前列腺癌细胞瘤苗能诱导有效的抗肿瘤免疫反应。     

基因修饰树突状细胞诱导移植免疫耐受研究进展

在移植免疫反应中 ,树突状细胞 (DC)作为专职抗原提呈细胞 ,既可活化T、B细胞生产免疫应答 ,同时某些类型DC由于缺乏共刺激分子或表达某些抑制性细胞因子而能诱导移植免疫耐受。针对DC提呈抗原及活化T、B细胞的多个环节 ,目前有许多策略将不同目的基因转染不同来源的DC ,让其表达不同的表面分子或分泌免疫抑制因子 ,以诱导移植免疫耐受     

吡咯烷二硫代氨基甲酸酯对树突状细胞成熟的影响

目的：观察NF-κB抑制剂吡咯烷二硫代氨基甲酸酯（PDTC）对树突状细胞（DC）成熟的影响。方法：利用PDTC作用于体外培养的大鼠不成熟DC，细菌脂多糖（LPS）刺激后，流式细胞仪检测DC共刺激分子CD80、CD86、CD40表达；ELISA分析DC分泌IL—12的变化，NF—κB DNA结合ELISA检测核内NF—κB活性。结果：PDTC抑制DC共刺激分子CD80、CD86、CD40表达；减少DC分泌IL-12；抑制核内NF—κB DNA结合活性。结论：PDTC抑制DC成熟。     

长链非编码RNA对前列腺癌调控作用的研究进展

LncRNA(long non-coding RNA),即长链非编码RNA,是一类长度超过200个核苷酸单位左右的非编码RNA,其可在表观遗传、转录水平及转录后水平参与调控细胞内各种生理过程。目前,已有大量文献报道,多种LncRNA的异常表达与前列腺癌的形成、进展和转移密切相关。通过体内体外实验验证,多种LncRNA在前列腺癌从激素敏感期进展至去势抵抗期具有重要调控作用。为此,该文就近几年来LncRNA在前列腺癌中的调控作用的研究进展进行了综述,可为前列腺癌的基因及表观遗传治疗提供参考。     

IκBα突变体基因修饰树突状细胞降低同种T细胞的反应性

目的观察IκBα突变体基因修饰的树突状细胞(IκBαM-DC)对同种T细胞的反应性。方法利用腺病毒载体将IκBαM基因转染WF大鼠骨髓树突状细胞(DC),Western-blot法检测DC中IκBα、IκBαM基因的表达;用流式细胞仪检测DC中共刺激分子MHCⅡ、CD80、CD86、CD40的表达;酶联免疫法(ELISA)分析DC分泌IL-12的含量。通过混合淋巴细胞反应(MLR)分析Lewis大鼠T细胞对IκBαM-DC刺激的增殖能力,二次MLR检测IκBαM-DC诱导的T细胞抗原特异性的低反应性。结果IκBαM抑制DC共刺激分子MHCⅡ、CD80、CD86、CD40的表达及IL-12分泌。同种T细胞对IκBαM-DC刺激的增殖能力较未转染的DC反应明显降低;T细胞低反应具有抗原特异性。结论表达IκBα突变体基因的DC能降低同种T细胞的反应性。     

臭氧氧化预处理在肾缺血再灌注损伤中对内皮型一氧化氮合酶表达的影响

目的 观察臭氧氧化预处理对大鼠急性肾缺血再灌注损伤的保护作用及其对内皮型一氧化氮合酶（eNOS）表达的影响.方法 38只8周龄雄性Wistar大鼠按随机数字表法随机分为4组.（1）假手术组（n＝8）：仅切除右肾;（2）缺血再灌注组（n＝10）：切除右肾、游离左肾后夹闭左肾动、静脉45 min再开通;（3）臭氧氧化预处理组（n＝10）：与缺血再灌注组建模方法一致,但在建模前15 d起每天1次经直肠灌注法吹入氧气和臭氧的混合气体5~5.5 mL;（4）氧气预处理组（n＝10）：与臭氧氧化预处理组建模方法一致,但经直肠仅吹入氧气（13 mg/kg）.建模后24 h检测各组大鼠血清肌酐、血尿素氮和血清一氧化氮浓度;48 h后采用免疫组织化学法和逆转录PCR法检测各组大鼠肾组织eNOS表达;蛋白质印迹法检测肾组织胞浆eNOS含量.结果 建模后24 h,缺血再灌注组大鼠血清肌酐为（117±20）μmol/L,血尿素氮为（32.8±7.6）mmol/L,血清一氧化氮为（58±12）μmol/L,均高于假手术组,差异有统计学意义（均P〈0.05）.臭氧氧化预处理组血清肌酐为（63±16）μmol/L,血尿素氮为（17.4±5.2）mmol/L,低于缺血再灌注组和氧气预处理组,差异有统计学意义（均P〈0.05）;血清一氧化氮为（84±14）μmol/L,均高于缺血再灌注组和氧气预处理组,差异有统计学意义（均P〈0.05）.臭氧氧化预处理组肾组织学Paller评分（41±6）低于缺血再灌注组（62±9）,eNOS灰度值（163±15）高于缺血再灌注组（126±18）,差异有统计学意义（均P〈0.05）.假手术组大鼠肾组织内有微量eNOS mRNA表达,缺血再灌注组、臭氧氧化预处理组和氧气预处理组eNOS mRNA表达增强,均高于假手术组（均P〈0.05）,臭氧氧化预处理组eNOS mRNA表达高于缺血再灌注组和氧气预处理组（均P〈0.05）.假手术组无明显eNOS蛋白表达,缺血再灌注组、臭氧氧化预处理组和氧气预处理组eNOS蛋白表达增强,均高于假手术组（均P〈0.05）,臭氧氧化预处理组eNOS蛋白表达高于缺血再灌注组和氧气预处理组（均P〈0.05）.结论 臭氧氧化预处理对大鼠肾缺血再灌注损伤有保护作用,作用机制可能与其诱导eNOS合成增多、一氧化氮产生增多有关.     

PcDNA3.1(-)-edPSMA载体的构建及其稳转鉴定

目的 构建人前列腺特异性膜抗原胞外区(edPSMA)真核表达质粒,并建立稳定表达edPSMA的小鼠前列腺癌(RM-1-edPSMA)的细胞株.方法 构建PcDNA 3.1(-)-edPSMA真核表达载体并测序,脂质体转染法分别将PcDNA 3.1(-)-edPSMA质粒和PcDNA3.1(-)空载质粒转染至RM-1细胞,G418筛选后获得了稳定生长的阳性克隆细胞株,逆转录.聚合酶链反应(RT-PCR)、Western blot检测edPSMA蛋门的表达.结果 质粒经酶切测序,结果与Gene Bank序列进行Blast比对分析,同源性为99.7%,RT-PCR和Western blot均证明转染了 PcDNA 3.1(-)-edPS-MA质粒的RM-1细胞表达edPSMA.结论 成功构建了PcDNA 3.1(-)-edPSMA质粒,并建立了稳定表达edPSMA的细胞株.