双龙接骨丸含药血清促进成骨细胞的增殖及其分子机制的研究

目的在体外研究骨伤药双龙接骨丸含药血清对成骨细胞增殖活动的影响,并对其分子机制进行初步探讨。方法制备双龙接骨丸含药血清,MTT 法观察体外含药血清对成骨细胞株 HFOB 1.19的促增殖作用,cDNA 微阵列技术分析含药血清导致的基因表达差异,寻找双龙接骨丸的可能作用途径。结果高、中、低剂量双龙接骨丸含药血清组较对照组均有明显促进 HFOB 1.19增殖的作用(P<0.01),此过程中至少有8种基因的表达量发生明显变化,其中 cAMP 依赖的磷酸激酶Ⅰ型调节亚基β(PKAP Ⅰβ)表达量上调1.8倍,GC 盒结合蛋白表达降低73%。结论初步判定双龙接骨丸含药血清在体外有促进人成骨细胞增殖的作用,并有可能是通过 cAMP 介导的信号传导途径进行的。     

rhbFGF转染人皮肤成纤维细胞的研究

将重组人碱性成纤维细胞生长因子(rhbFGF)基因克隆入真核表达载体pEGFP-N1质粒增强型绿色荧光蛋白(EGFP)基因上游，并在其5′端加上白介素-4的信号肽序列，形成融合基因，利用脂质体转染原代培养的成纤维细胞，荧光显微镜和蛋白质印迹杂交检测rhbFGF-EGFP融合蛋白的表达，细胞计数法观察bFGF对细胞生长的影响。结果表明成功构建了pEGFP-rhbFGF质粒，并经脂质体介导有效地转入原代培养的人皮肤成纤维细胞内。用G418筛选纯化转基因后的细胞能够向胞外分泌rhbFGF活性物质，明显促进成纤维细胞自身的增殖。表明bFGF基因转染能够稳定有效地促进成纤维细胞的增殖。     

真核蛋白编码基因核心启动子元件

核心启动子(core promoter,CP)是位于转录起始位点附近由100个左右核苷酸所构成的功能区域,负责与转录因子结合同其它顺式作用元件如增强子、沉默子一起对转录进行调控。目前所发现的真核蛋白编码基因核心启动子元件包括:TATA盒、上游启动子元件BRE、起始子Initiator(Inr)、下游启动子元件DPE以及新发现的位于DPE附近的十基序元件MTE。上述核心启动子元件普遍存在于真核蛋白编码基因之中,对真核生物的生长、发育、适应环境起着重要作用。     

C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞Dlxin 1基因表达及骨形态发生蛋白2的调控机制

背景:Dlxin 1可与成骨相关转录因子Dlx、Msx家族成员相互作用调节其转录活性,骨形态发生蛋白2可诱导小鼠胚胎成纤维细胞(C3H10T 1/2)向成骨细胞分化.目的:对C3H10T 1/2小鼠胚胎成纤维细胞中Dlxin 1基因的表达及骨形态发生蛋白2调控机制进行初探.设计、时间及地点:细胞分子水平实验,于2007-03/10在暨南大学生物工程研究所实验室完成.材料:C3H10T 1/2细胞为ATCC产品,骨形态发生蛋白2为自产,DH5α为自备.方法:用荧光定量PCR(qRT-PCR)检测骨形态发生蛋白2对基因表达的影响,用双荧光报告载体系统搜寻Dlxin 1的上游启动子元件,用凝胶迁移实验(EMSA)对其精确定位.主要观察指标:①细胞中Dlxin 1基因mRNA的表达情况.②pGL3-Dlxin 1系列缺失突变报告载体荧光活性及启动子片段与C3H10T 1/2细胞核蛋白的结合能力检测.结果:在转录水平上骨形态发生蛋白2可以诱导Dlxin 1基因表达上调;Dlxin 1启动子基础活性和骨形态发生蛋白2诱导活性调控区域均位于转录起始位点上游-943～-728 bp之间;EMSA证实,-758～-748 bp这一片段是调控核心区域.结论:转录因子通过与Dlxin 1启动子上游TATA box结合来调控Dlxin 1基因的转录.     

骨形态发生蛋白2诱导成骨分化与长链非编码RNA AK007000的影响

背景：长链非编码RNA调控一系列生理过程,被认为在发育、分化和代谢的基因调控中发挥重要的作用。MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞可向骨细胞、肌细胞等多个方向分化,用于肌肉骨骼等运动系统相关疾病的研究。 目的：观察长链非编码RNA在骨形态发生蛋白2诱导成骨分化中的作用。 方法：对MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2细胞在骨形态发生蛋白2诱导下,成骨分化过程中的长链非编码RNA表达变化进行芯片分析,找到在3株细胞中同时变化的长链非编码RNA,siRNA干扰方法观察长链非编码RNA对骨形态发生蛋白2诱导成骨分化的影响,采用Real-Time PCR与碱性磷酸酶染色检测成骨相关指标。 结果与结论：骨形态发生蛋白2诱导MC3T3-E1、C2C12和C3H10T1/2成骨分化过程中,相应成骨指标增高,成肌指标肌细胞生成素降低。筛选出骨形态发生蛋白2诱导成骨分化过程中出发挥作用的长链非编码RNA AK007000。AK007000被干扰后成骨分化指标碱性磷酸酶、骨钙素、RUNX2、SP7表达下降,肌细胞生成素表达上升。因此,AK007000可能具有促进成骨抑制成肌作用。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

抗凝血酶Ⅲ活性检测在儿童患者中的应用价值

目的对儿童患者的抗凝血酶Ⅲ活性进行检测,探讨其在临床中的应用价值及不同疾病中的关联性。方法收集2016年5月—2019年12月上海儿童医学中心抗凝血酶Ⅲ活性检测标本14 868例次,使用ACL TOP700全自动血凝仪及发射底物法检测血浆抗凝血酶Ⅲ活性,采用Graphpad prism 8软件对检测结果进行统计分析。结果抗凝血酶活性Ⅲ与性别无关,但在紫绀型先心病、大动脉畸形、重症肺炎、暴发性心肌炎中抗凝血酶Ⅲ活性降低。结论部分疾病可影响抗凝血酶Ⅲ活性,同时抗凝血酶Ⅲ活性也与疾病的病程呈相关性。     

小鼠Gas6启动子的克隆与功能鉴定

目的:探讨软骨分化的负性转录因子Gas6基因启动子调控的分子机制。方法:采用5′RLM-RACE技术克隆Gas6的转录起始位点,利用生物信息学的方法对Gas6潜在启动子区域在小鼠、人与大鼠之间进行同源性比较,对Gas6上游序列进行系列缺失突变,构建Luciferase基因报告载体,转染细胞后检测Luciferase的表达水平。结果:Gas6的转录起始位点为碱基C,在小鼠、人与大鼠之间存在两个高度保守序列A-box与B-box,缺失A-box,B-box的后1/2区域以及NF-Y结合位点后,潜在启动子的转录活性明显下降。结论:A-box,B-box及NF-Y结合位点与Gas6的转录活性有关。     

TNF-α对肾脏近端小管上皮细胞caspase-3的调控作用及其机制

目的:探讨肿瘤坏死因子-α(TNF-α)对大鼠原代肾小管上皮细胞半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(caspase-3)激活与表达的调控以及核因子-κB(NF-κB)在其中的作用。方法:体外分离与培养大鼠肾小管上皮细胞,以TNF-α(10μg/L)按不同时间给予刺激,Western blotting检测caspase-3及其活化裂解片段cleaved caspase-3,以及I-κBα和磷酸化I-κBα(pI-κBα)蛋白水平。分别以TNF-α(10μg/L)处理24h、NF-κB特异性抑制剂Bay11-7082(5μmol/L)处理25h、Bay11-7082(5μmol/L)预处理1h后加入TNF-α(10μg/L)刺激24h,检测caspase-3及cleaved caspase-3的变化。结果:TNF-α刺激6至24h,cleaved caspase-3与caspase-3的相对比值显著高于对照组;而caspase-3蛋白水平在TNF-α刺激后6h无明显增高,12h低于对照组,24h回升;Bay11-7082处理组和Bay11-7082+TNF-α处理组的caspase-3蛋白表达与活化水平显著低于TNF-α处理组和对照组。结论:TNF-α促进大鼠原代肾小管上皮细胞caspase-3的激活与表达,这一过程与NF-κB的激活有关。