Duchenne型肌营养不良症病人中出现"返祖纤维"的免疫荧光和分子生物学研究

目的：探讨临床诊断为Duchenne型肌营养不良（Duchenne's muscular dystrophy,DMD)病人的免疫荧光检测中出现“返祖纤维”现象的可能机制。方法；对病人的肌肉组织行免疫荧光检查抗肌营养不良蛋白（dystrophin)抗体，并同时对病人DMD基因中的25个外显子进行检测。结果：21例病人中有5例出现“返祖纤维”现象，即在免疫荧光检测中有单个或一小簇肌纤维呈阳性反应，其余呈阴性表现，多重PCR检测该5例病人，其中3例有外显子缺失。结论：“返祖纤维”现象提示：病人的个别肌纤维可能存在完整的抗肌营养不良蛋白基因表达，其发病机制可能有别于传统意义上的DMD发病机制。“返祖纤维”现象可用来评估病人的预后，并为临床治疗提供一些新的思路。     

桥本甲状腺炎患者白介素-2及受体与甲状腺过氧化物酶抗体的关系

目的：探讨桥本甲状腺炎（HT）患者外周血中白介素-2（IL-2）及白介素-2受体（IL-2R）与甲状腺过氧化物酶抗体（TPoAb）的关系。方法：将86例HT患者分为初诊、复诊2组,并另选20名健康体检者作为正常对照组。采用酶联免疫吸附（ELISA）夹心法检测受检者外周血中的IL-2及IL-2R,并采用微粒子酶免化学发光分析法检测TPoAb浓度水平,观察IL-2及IL-2R与TPoAb的关系。结果：IL-2在初诊HT组、复诊HT组与正常对照组中的含量分别为（25.01±3.31）ng/L、（23.17±5.89）ng/L和（24.05±3.92）ng/L,3组间两两比较,差异无统计学意义（P〉0.05）;IL-2R在初诊HT组、复诊HT组和正常组水平分别为（1125.94±743.87）ng/L、（722.93±640.06）ng/L和（293.48±113.35）ng/L,3组间两两比较,差异均有统计学意义（P均〈0.05）。复诊HT组的TPoAb含量为（169.75±44.36）IU/L,高于正常组的（8.30±1.70）IU/L,低于初诊HT组的（460.96±299.05）IU/L,3组间两两比较,差异均有统计学意义（P均〈0.05）。HT患者外周血中的IL-2R含量与TPoAb水平呈正相关（r=0.696,P〈0.01）。结论：HT患者外周血IL-2R含量升高,且与TPoAb水平呈正相关,检测IL-2R含量有助于观测患者的免疫功能状态。     

桥本甲状腺炎患者外周血中B细胞的检测意义

桥本甲状腺炎（Hashintoto＇s thyroditis,HT）是一种器官特异的功能性自身免疫性疾病,病变以淋巴细胞浸润以及甲状滤泡上皮细胞破坏凋亡为主,而外周血中B淋巴细胞数量的增多与否,可对病变发展产生影响^[1]。探讨HT患者外周血中B淋巴细胞CD20^＋、CD45RA^＋与甲状腺过氧化物酶抗体（TPO-Ab）和甲状腺球蛋白抗体（TG-Ab）升高之间的关系,对于监测病变的性质可能有一定帮助。     

Beckman Coulter LH750血液分析仪复检规则的制定和评价

目的制定和评价本院Beckman Coulter LH750血液分析仪复检规则。方法上海瑞金医院门诊与病房标本共1000份乙二胺四乙酸二钾（EDTA-K2）抗凝的全血标本对复检规则草案进行评估,另选取2007年8月至2007年9月经血常规审核软件DM2审核的门诊、病房20695份标本结果对复检规则进行评价。结果通过检测1000份标本,其2．2％的假阴性低于国际血液学复检专家组制定5％的最大允许范围。其假阴性主要集中于有核红细胞、红细胞形态和血小板形态3个项目。经对20695份标本结果进行分析,本室复检规则自动确认占总标本的66．4％,需复检占33．6％,仪器报警分布以中晚幼粒细胞（IMM．NE2）报警为多,占44．4％,血小板聚集（PLT Clumps）其次,占16．9％,细胞计数超出审核范围共5943项,以血小板计数为多（28．4％）,其中首次结果超出审核范围的以白细胞（29．9％）、血小板（31．6％）居多,与历次前后差异结果相比较（8-check）未通过审核的共1148例,以血小板计数居多。结论目前,复检规则的制定和执行越来越受到重视,可以提高血常规检验质量,减少差错,我院采用白细胞分类百分比作为衡量指标,相对“41条复检规则”中的白细胞分类规则,我院的分类采用的百分比作为衡量指标要求更为严格,减少了其假阴性的发生率。加大血小板复查量,可有效地发现假性血小板聚集,提高了我院的报告质量。关于历史结果我院因门诊患者一般1至2周复诊,故将历史结果比较定在2周。允许范围初步订在20％,但仍需对此进行进一步的探讨。     

多重聚合酶链反应检测DMD基因的初步分析

目的 在更广泛的区域内寻找ＤＮＤ基因的缺失范围。方法 用２５对引物以多重ＰＣＲ技术对１７例ＤＭＤ或ＢＭＤ患者进行ＤＭＤ基因检测。结果 ８例患者（４７．１％）被检出ＤＭＤ基因片段性缺失,其中７例患者的缺失部位集中在４４～５１号外显子,另１例患者的缺失部位处于ＤＭＤ基因的５′端。结论 我国ＤＭＤ或ＢＭＤ患者ＤＭＤ基因的缺失热点主要位于该基因的中央部位,但亦有基因上游大片段的缺失。     

遗传性疾病的基因诊断

分子生物学理论和技术的飞速发展、人类基因组计划的突破性成就,为人们认识和诊断遗传性疾病提供了有效的手段[1].通过研究遗传性疾病的致病基因DNA结构以及转录或翻译水平的异常,已初步揭示了其中部分疾病的分子遗传学基础,成为临床疾病诊断和分类的重要依据.分子生物学中具有独创性和革命性的新方法、新技术的问世及其向医学领域的渗透,使遗传性疾病的基因诊断逐渐走出研究部门的实验室,转化为常规的临床检查项目,成为临床医学的一个重要组成部分.     

HCV基因转染的肝癌细胞体内外生长的实验研究

目的 研究丙型病毒性肝炎病毒(HCV)感染对宿主肝细胞体外生长速度和体内肝癌生长特性的意义. 方法体外培养HCV基因转染的肝癌细胞(HepG2-HCV)和对照细胞(HepG2-vector),以MTT比色法测定两种细胞的生长速度.19只裸鼠分为三组:MEM培养液组(n=6)、HepG2-HCV组(n=7)和HepG2-vector组(n=6),分别于皮下注射无血清MEM培养液、HepG2-HCV、HepG2-vector细胞各0.2 mL,细胞密度为5×107/mL,观察皮下肿瘤的形成情况,并对小鼠肿瘤和肝、脾、肾、肺、心等脏器作病理学分析.结果 HepG2-HCV的生长速度较对照细胞明显加快,在无血清培养条件下其生长优势更显著.体内成瘤实验结果显示,HepG2-HCV和HepG2-vector两种细胞使实验鼠形成皮下肿瘤的比例分别为71.43%和83.33%,两组间差异无统计学意义(P＞0.05).病理学分析表明,HepG2-HCV组形成的5例实验肿瘤生长良好,片状坏死的发生率为0;HepG2-vector组5例肿瘤组织中均存在片状坏死,发生率为100%,两组间差异有统计学意义(P<0.05).两组肝、脾、肾、肺、心等脏器的病理学分析均未见明显异常.结论 HCV促进肝癌细胞加速生长,并使组织中肿瘤细胞处于良好生长状态.     

斑点免疫金渗滤法定量测定血清淀粉样蛋白A方法的建立及性能评估

目的建立斑点免疫金渗滤法（DIGFA）定量测定血清淀粉样蛋白A（SAA）并评估其分析性能。方法选用2株商品化抗SAA单克隆抗体，分别结合于硝酸纤维素膜和胶体金，制备免疫金渗滤试剂板条（SAA—DOT）以定量检测SAA。按照EP文件，评估SAA—DOT的分析性能（检测限、精密度、准确性、线性范围等）。结果SAA—DOT最低检测限为5mg／L；10和100mg／L的批内变异系数（CV）分别为9．07％和10．21％，天间CV分别为11．33％和11．53％；线性范围为5—230mg／L；SAA—DOT的测定结果与商品化乳胶增强速率散射比浊法（LERN）试剂具有良好的相关性（r=0．995，P〈0．05）。表观健康者血清SAA浓度中位数为5．7mg／L，95％可信区间为0—9．6mg／L。结论基于DIGFA的SAA-DOT简便、快速，能在5min内完成检测，各项分析性能指标达到国家食品药品监督管理局（SFDA）对体外诊断试剂的要求，可用于临床患者血清标本的检测。     

Dysferlin缺陷:肢带2B型肌营养不良与Miyoshi肌病的致病原因

目的　对临床怀疑为常染色体隐性遗传性肌营养不良一家系进行分析 ,以明确肌病类型并寻找其致病基因的分子缺陷。方法　用与 8种常染色体隐性遗传性肌营养不良基因连锁的短串联重复序列标记进行连锁分析 ,用与 5种肌营养不良相关的单克隆抗体作多重免疫印迹分析检测相应致病基因的编码产物 ;通过逆转录 - PCR扩增先证者致病基因的编码序列并测序 ,确定基因突变。结果　家系连锁分析显示在 DYSF基因附近的 D2 S337位点的优势对数记分值为 1.85 ,提示致病基因与 D2 S337连锁 ;免疫印迹分析提示患者DYSF基因的编码产物 dysferlin缺陷 ;测序证明先证者DYSF基因的c DNA第 6 4 2 9位发生纯合性del G突变。结论　综合研究结果和临床资料 ,这一家系中的先证者被诊断为 Miyoshi肌病 ,由DYSF基因纯合性缺失突变所导致。     

实时荧光PCR检测宫颈组织TSLC1基因方法的建立和应用

目的 建立实时荧光PCR检测宫颈组织TSLC1基因的方法,提高TSLC1基因检测方法的灵敏度和精密度.方法 用Light Cycler(R) R480 PCR仪根据设计好的引物与探针,在一定的反应条件下检测宫颈组织TSLC1基因,采用罗氏Light Cycler(R) R480 PCR专用软件进行数据分析.结果 该方法最低检测量为103 copies/ml,检测范围为107～102 copies/ml,10次总的Ct值CV为1.7%.结论 所建立的实时荧光PCR检测各类宫颈组织,正常组织低度鳞状上皮内病变(LSIL)、高度鳞状上皮内病变(HSIL)、宫颈癌组织TSLC1基因的表达率分 别为100%,72%,56%,23%,可以作为进一步研究TSLC1基因表达在肿瘤早期诊断中的价值的重要工具.