利用增强型绿色荧光蛋白体外表达探讨逆转录病毒转染软骨细胞的最佳条件

背景:增强型绿色荧光蛋白是目前最佳标记分子,具有荧光特异性高、易于检测等独特的优势,利用基因工程技术构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,转染同种异体软骨细胞值得研究。目的:构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,探讨转染同种异体软骨细胞的最佳条件。设计:随机对照观察。单位:上海交通大学。材料:选用30只出生1周的新西兰白兔,雌雄不限,均购自中国科学院实验动物研究中心。双嗜性逆转录病毒包装细胞系PT67购自Clontech公司;小鼠成纤维细胞NIH3T3细胞购自ATCC公司;DH5a大肠杆菌由本实验室保存;逆转录病毒载体pLNCX2购自Clontech公司;带有增强型绿色荧光蛋白的pEGFP-C1质粒由中科院细胞所丛笑倩教授惠赠。方法:实验于2005-08在上海交通大学完成。分离提取并培养新西兰白兔软骨细胞,利用基因工程技术构建能稳定表达增强型绿色荧光蛋白的重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2,转染培养后的新西兰白兔软骨细胞,荧光显微镜观察转染的效果。于直径10cm的平皿接种6×105个软骨细胞,分别立即转染及接种12,24,48h后转染逆转录病毒-EGFP,1周后作流式细胞仪测定EGFP表达效率,观察逆转录病毒转染原代软骨细胞最佳时机。软骨酶消化后的软骨细胞接种24h后转染逆转录病毒,分别于第2,3,4,5,6天加250mg/LG418进行筛选。PBS洗涤后作流式细胞仪检测其效率,观察G418筛选的最佳时机。主要观察指标:①EGFP-pLNCX2转染效果。②逆转录病毒转染原代软骨细胞及G418筛选最佳时机。结果:①重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2转染原代兔软骨细胞,经G418初步筛选而获得的高表达格局,可见软骨细胞经过筛选和表达绿色荧光蛋白后,保持正常的形态学,细胞伸出伪足贴壁,基质分泌旺盛。②逆转录病毒转染原代软骨细胞的最佳时机为细胞接种培养后24h,第7天用流式细胞仪测定转染效率为19.14%,G418筛选的最佳时机为培养后第5天,第7天测定表达效率提升为55.75%。结论:重组逆转录病毒载体EGFP-pLNCX2能有效地转染软骨细胞,逆转录病毒转染原代软骨细胞的最佳时机为细胞接种培养后24h,G418筛选的最佳时机为培养后第5天。     

精氨酸酶Ⅰ在HCV转染肝癌细胞增殖中的作用

目的:研究丙型肝炎病毒(hepatitis C virus,HCV)基因组转染的肝癌细胞中精氨酸酶Ⅰ的表达及其意义,探究其在HCV-肝细胞肝癌(HCC)发病中的作用.方法:以转染HCV基因组的人肝癌细胞系(Huh7)为研究对象,采用蛋白印迹技术研究HCV基因组转染对细胞内精氨酸酶Ⅰ表达的影响;运用小干扰RNA(siRNA)技术抑制细胞精氨酸酶Ⅰ表达,并探讨其对细胞生长的影响及作用机制.结果:精氨酸酶Ⅰ在HCV阳性肝癌细胞系(Huh7-HCV)中的表达上调,且与对照细胞相比,Huh7-HCV细胞的精氨酸酶Ⅰ含量升高4.3倍.运用siRNA抑制细胞精氨酸酶Ⅰ表达,可明显抑制细胞生长并导致其死亡,且可使细胞周期发生明显改变.结论:精氨酸酶Ⅰ在HCV阳性肝细胞Huh7中表达上调,可能对促进Huh7-HCV细胞生长具重要意义.     

DMD基因及其产物检测的临床价值

目的针对ＤＭＤ基因的突变特点以及由此而产生的编码产物的异常,探讨ＤＭＤ基因及其编码产物──抗肌营养个良蛋白的检测对于诊断疾病的意义。方法用多重ＰＣＲ技术和免疫印迹技术对ＤＭＤ或ＢＭＤ患者的ＤＭＤ基因和抗肌营养不良蛋白进行了检测。结果３３．３％的ＤＭＤ患者虽然未被检测出基因的片段性缺失,但他们的抗肌营养不良蛋白却完全丧失。结论多重ＰＣＲ技术是检测ＤＭＤ基因片段性缺失的有效方法,但却无法检测出点突变等微小突变。兔疫印迹技术能反映由于各种类型的基因突变所造成的编码产物的缺陷,更有利于ＤＭＤ和ＢＭＤ的确实诊断,应将其作为主要的实验室检测指标之一。     

儿童慢性特发性多发性肌炎诊治中的若干问题

特发性多发性肌炎（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃ ｐｏｌｙｍｙｏｓｉｔｉｓ,ＩＰＭ）是一种病因不明的、主要侵犯骨骼肌的结缔组织疾病,病理改变的主要特征为骨骼肌细胞坏死及间质内炎性细胞灶性浸润,可合并有肌纤维再生。该病在儿童中并不少见,有时与Ｄｕｃｈｅｎｎｅ／Ｂｅｃｋｅｒ型肌营养不良（Ｄｕｃｈｅｎｎｅ／ＢｅｃｋｅＲ Ｍｕｓｃｕｌａｒ Ｄｙｓｔｒｏｐｈｙ,ＤＭＤ／ＢＭＤ）不易鉴别,尤其是在亚急性和慢性病例中,有必要正确识别两者。因为前者可治,后者难治。我们结合３个病例,探讨儿童多发性肌炎诊治中的若干体会。１ 资料…     

培养适应学科发展需要的检验医师——我国医学检验教育的当务之急

医学检验科是以诊断、预防、治疗人体疾病或评估健康状况提供信息为目的,对取自人体的材料进行生物学、生物化学、微生物学、免疫学、血液学、血液免疫学、细胞学、生物物理学等检验,是临床医学二级学科。医学检验科还可以从实验室的角度为临床科室提供咨询性服务,包括实验结果     

比较重复序列PCR与多位点序列分型技术用于光滑假丝酵母菌的基因分型检测

目的 评价REP-PCR基因分型技术在临床光滑假丝酵母菌株分型中的应用价值。方法收集2009-2010年上海瑞金医院、上海仁济医院、上海华山医院、安徽医科大学附属医院、深圳人民医院38株光滑假丝酵母菌。采用MLST法扩增光滑假丝酵母菌的6个管家基因内片段,扩增片段测序后与数据库数据比对得出等位基因谱,从而得到相应的序列型（sequence type,ST）。采用REP-PCR法设计Ca21、Ca22、Com21引物扩增38株光滑假丝酵母菌重复序列,通过电泳比较分析,获得REP-PCR型。比较两种分型方法的结果和效率。结果 以Ca22-Com21为引物的REP-PCR分型效果最好。REP-PCR和MLST分型结果相同,38株光滑假丝酵母菌共产生5种REP-PCR型,分别为A、B、C、D、E型,对应于MLST的ST7、ST3、ST19、ST45和新型。REP-PCR比MLST耗时短。结论REP-PCR方法简单快速,且分辨率与MLST技术相同,可作为实验室大量菌株分型的首选方法。     

卵巢恶性肿瘤组织中u-PA、t-PA mRNA的表达

目的 :检测尿激酶型纤溶酶原激活剂 (u PA)和组织型纤溶酶原激活剂 (t PA)两因子的mRNA在卵巢肿瘤组织中的表达水平 ,初步探讨肿瘤细胞纤溶活性的变化与相关基因间的联系。方法 :采用实时监测荧光定量RT PCR技术 ,检测并比较卵巢恶性肿瘤组织和良性囊肿组织 (卵巢巧克力囊肿 )中u PA及t PA基因的表达。结果 :u PAmRNA在恶性肿瘤组织中的表达较良性卵巢囊肿组织中的表达显著升高 (P <0 .0 5 )。良性囊肿组织所表达的t PAmRNA较恶性组织显著升高 (P <0 .0 5 )。在高、中、低 3种分化程度的恶性肿瘤中 ,u PAmRNA拷贝数随肿瘤分化程度的降低而增加 (P <0 .0 5 ) ,t PAmRNA拷贝数随其分化程度的降低而降低 (P <0 .0 5 )。结论 :恶性肿瘤组织的u PA基因在转录水平上调 ,可能与卵巢肿瘤的恶性进展相关。t PA基因在转录水平下调 ,t PA在mRNA水平的高表达可能是组织分化较好的特征。     

TIGAR基因真核表达载体的构建及在HepG_2细胞中的作用初探

目的:构建TP53诱导的糖酵解和凋亡调控子(TIGAR)全长cDNA的真核表达载体pEGFP-TIGAR,观察TIGAR在人肝细胞HepG2中的作用。方法:RT-PCR技术扩增获得TIGAR全长cDNA,将扩增的产物克隆,经酶切、DNA测序鉴定正确,构成pEGFP-TIGAR的真核表达重组质粒。利用脂质体将重组质粒转染入HepG2细胞,流式细胞仪和TUNEL法检测细胞凋亡、流式细胞仪检测细胞周期、MIB-1(Ki-67抗原测定)法检测细胞增殖、实时荧光PCR检测mRNA表达和Western-blot检测蛋白质的表达。结果:构建完成的真核表达重组质粒pEGFP-TIGAR,经DNA测序与GenBank中的人TIGARcDNA序列一致。荧光显微镜观察到转染重组质粒的细胞中有绿色荧光蛋白的表达。检测结果显示,转染pEGFP-TIGAR质粒的HepG2晚期凋亡细胞明显减少(P<0.05);S期细胞百分数则明显增加(P<0.05),增殖能力明显增高(P<0.05)。结论:本实验成功构建了pEGFP-TIGAR真核表达质粒,过表达的TIGAR可降低HepG2细胞发生晚期凋亡和促进细胞增殖,为进一步研究TIGAR基因在肿瘤细胞中作用提供了基础。     

医学检验专业学制"五改四"的实践与体会

早在1983年,为适应改革开放的形势对医疗卫生事业的发展和对医学检验人材的要求．上海交通大学医学院即原上海第二医科大学在国内首批开设了医学检验本科教育,成为国内最早开办检验系的高等医学院校之一。随着国家改革开放的深入,医学检验技术的高速发展,医学检验已进入全新时代。本着与时俱进的态度,为了更好地适应现代检验医学快速发展的要求及社会对新型实用型医学检验人才的需求,我校医学检验专业学制于2003年由原来的五年制改为四年制．在实践过程中积极探索、大胆创新,     

血脂与肝脂酶启动子514C/T多态性的关系

目的:探讨肝脂酶(HL)启动子514C/T基因多态性与血脂水平的关系。方法:用聚合酶链反应-限制性内切酶片段长度多态性分析技术(PCR-RFLP),对112名三酰甘油(TG)正常水平者和103例高TG者的HL启动子514C/T基因多态性进行研究。结果:HL启动子514TT等位基因频率在高TG组为0.4563,比正常TG组0.3348高,但差异无显著性。在总研究组中TT型的年龄、TG浓度明显高于CC型和CT型,而载脂蛋白A1(ApoA1)则明显降低(P<0.05)。按性别分层后发现TT型女性和男性的TG、低密度脂蛋白胆固醇(LDL-C)的浓度均明显高于非TT型同性(P<0.05),而高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、ApoA1浓度则分别低于非TT型的同性(P