骨髓间充质干细胞在膀胱脱细胞基质上的生长及分化

背景:传统方法多采用平滑肌细胞和移行上皮细胞构建组织工程膀胱,并进行支架材料的双面种植,但由于平滑肌细胞取材培养困难,且体外传代有限,双面种植较为困难.目的:实验拟验证以骨髓间充质干细胞及膀胱脱细胞基质构建组织工程膀胱的可行性.设计:基础实验研究.单位:中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心.材料:实验于2006-03/2007-05在中山大学附属第二医院林百欣医学研究中心完成.实验室级别为卫生部部属医院开放实验室.1月龄SD大鼠,雌雄不限,体质量80～100g,由中山大学实验动物中心提供.新鲜猪膀胱取自南方医科大学动物实验中心.方法:采用全骨髓培养连续贴壁法体外培养大鼠骨髓间充质干细胞,并应用流式细胞仪检测其表面抗原.采用去污剂洗涤法制备猪膀胱脱细胞基质,并测定其纯度及特性.将第3代骨髓间充质干细胞接种到膀胱脱细胞基质上,以添加25 ng/L血管内皮生长因子(VEGF165)的培养液进行体外、体内复合培养,检测其相容性.体内实验以细胞单独培养为对照,体外实验以未植入细胞的材料为对照,并模拟合适的微环境诱导骨髓间充质干细胞生长分化,分别在4,8周后取出动物体内的复合材料行组织切片检查,并进行免疫组织化学角蛋白染色,检测上皮细胞再生情况.主要观察指标:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质的生物相容性.结果:①采用全骨髓法成功培养出骨髓间充质干细胞,行流式细胞仪检测细胞表面抗原显示,传代第3代细胞CD29阳性细胞为99.43%.②制备的膀胱脱细胞基质具有良好的生物特性,镜下见均质状态的基质和细丝状的胶原纤维.体内外相容性实验表明骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的相容性,细胞生长状态良好.③4周后组织切片检查可见组织中较多炎症细胞浸润,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、不连续的单层上皮生长,8周后可见组织中已无明显炎症细胞浸润反应,胶原及弹性纤维排列紧密,免疫组织化学角蛋白染色见有薄层、连续的多层上皮生长.结论:骨髓间充质干细胞与膀胱脱细胞基质具有良好的生物相容性,并且在体内与周围组织有良好的生物相容性,可以作为构建组织工程膀胱的材料.     

前列腺癌LNCaP细胞L-plastin启动子-1751C/T单核苷酸多态性导致与转录因子NKX3.1结合活性改变

目的 鉴定与前列腺癌LNCaP细胞肌动蛋白结合蛋白L-plastin启动子-1751C/T单核苷酸多态性位点结合的转录因子,并研究-1751C/T单核苷酸多态性导致与转录因子结合活性的改变.方法 应用荧光素酶活性实验和凝胶迁移实验分析是否有转录因子结合于L-plastin启动子的-1751C/T位点.应用生物信息学分析L-plastin启动子-1751位点可能的结合蛋白,并应用凝胶迁移超滞后实验证实.应用Western blot检测该蛋白在正常前列腺上皮及前列腺癌细胞中的表达水平.结果 有一个抑制性转录因子结合于L-plastin启动子的-1751T序列上.生物信息学预测L-plastin启动子-1751位点可能的结合蛋白有5个可能,凝胶迁移超滞后实验证实为NKX3.1.NKX3.1在前列腺癌细胞中过表达,与L-plastin启动子-1751T序列较-1751C序列有更高的亲和力结论 L-plastin启动子-1751C/T单核苷酸多态性导致与NKX3.1结合活性改变,可能与前列腺癌发病相关.     

斜卧位微创经皮肾镜取石术55例报告

目的探讨斜卧位施行微创经皮肾镜取石术(PCNL)的方法及疗效。方法肾多发性结石或鹿角型结石患者55例。男36例,女19例。行患侧输尿管逆行插管,用自制体位架固定患者,患侧抬高45°,腰部向患侧突出,垫板的腰部位置留40 cm×20 cm缺口用于增加穿刺空间。C臂X线机定位下,于腋后线肋缘下进针,针尖向上倾斜与水平夹角5°～20°方向指向中组肾盏或结石穿刺,沿导丝扩张形成18～22 F的工作通道。置入短输尿管镜,采用钬激光或气压弹道碎石器在灌注泵配合下边冲洗边碎石。结果55例均一期完成手术,无穿刺失败或中转开放手术。手术时间(129.4±34.8)min。出血量(191.2±42.2)ml,2例术中输血200 ml。结石清除率74.5%(41/55)。无术中大出血,无肠道、肝脾脏损伤及胸膜损伤等并发症,术后并发症为早期尿漏1例、肾周血肿1例、继发出血1例。结论斜卧位施行PCNL手术利于术中麻醉监护,提高了手术安全性,有助于术中碎石排出,手术效果良好。     

p65基因序列shRNA慢病毒载体构建及其作用功能的初步研究

Objective To obtain shRNA sequences that can stably block the expression of Nuclear Factor kappa- B (p65) in the prostate cancer cell line LNCaP and construct the lentivirus vector.And validate the gene function of p65 in the cell line. Methods According to p65 genetic information, we design siRNA1, siRNA2, siRNA3 those three siRNA sequences targeting the ods area of p65 gene and then form the corresponding four pairs of complementary single strand DNA of shRNA, including the sense strand and the antisense strand. The synthetic shRNA sequence was inserted into the empty pSIH1-H1-copGFP shRNA Vector, and after transfecting the prostate cancer cells , the inhibitory effect of p65 mRNA by different sequences was detected through real-time PCR, and the inhibitory effect of p65 protein expression was detected by Western-blotting. Thus we can obtain highly effective shRNA sequences in the inhibition of p65 in prostate cancer cells. MTT, flow cytometry, transwell were chosen to test the cell growth, migration and invasive power in vitro to compare the difference of the experimental group, control group and negative group. Results The third shRNA sequence had the best inhibitory effect and the inhibitory effect of p65 mRNA in prostate cancer cell line was 59 % and the protein was 81%. It's position locates in p65 (NM_021975 ) 1096-1113 and it's stemloop sequence is 5'-GATCCGCCCTATCCCTTTACGTCATTCAAGAGATGACGTAAAGGGATAGGGCTTTTTG-3'. After transfecting, the prostate cancer cell line had the low expression of p65 stably. Through MTT, we got the growth curve, which showed that the growth ability of experimental group was significantly decreased compared with the control group and the Logarithmic growth didn't appear in the first 96 hours. Flow cytometry test displayed that the percentage of G0-G1-phase cells in experimental group was 61.49%, and the control group was 44.89%, idle group was 41.52%, which was increasing oberviously. The S-phase cells in the experimental group was 28.58%, compared with the 47.36% and 46. 10% diminished. The results of transwell showed that the experimental group had 16. 5000±6. 62076 cells and the other two groups had 45. 6333 13. 54159 and 36. 8333±5. 68412 cells, which showed the invasive power of experimental group was significantly declined(P＜0.05).Conclusions It's successful to obtain shRNA sequences that can stably block the expression of p65 in the prostate cancer cell line LNCaP and construct the lentivirus vector. p65 can positively regulates the biological behavior of prostate cancer LNCaP cell line in the cell growth, migration and invasive power.     

L-plastin启动子单核苷酸多态性与前列腺癌遗传易感性的相关性研究

目的 研究L-plastin启动子单核苷酸多态性(SNP)与前列腺癌的关系.方法 采用Tm-shifting(等位基因特异性扩增结合融解温度曲线分析法)分析方法,对82例前列腺癌人群和94例对照人群的L-plastin启动子SNP位点的基因型进行检测.结果 L-plastin启动子TT、CT、CC基因型及等位基因T、C在汉族前列腺癌患者及对照者中的分布频率差异无显著性(P>0.05);在前列腺癌组内不同病理分级中,中、高分化组和低分化组中TT、CT、CC基因型分布频率差异无显著性(P>0.05);在前列腺癌组内不同临床分期中,与TT纯合子相比,CC纯合子前列腺癌Ⅳ期的风险增加至5.0倍(P<0.05).结论 L-plastin启动子单核苷酸多态性在中国汉族人群中与前列腺癌无相关,但该启动子多态性可能在预测前列腺癌进展中有一定作用.     

单孔后腹腔镜下肾切除术九例报告

目的 探讨经腹膜后入路单孔腹腔镜下肾切除术的方法.方法 2009年4-10月行单孔后腹腔镜下肾切除术9例.男6例,女3例.年龄(50.9±14.1)岁.无功能积水肾5例、无功能萎缩肾1例、T_1肾癌3例.左侧5例、右侧4例.气管内插管麻醉,侧卧位,切开法进入腹膜后间隙,置入自制多通道套管.经套管置入30°标准腹腔镜及操作器械行肾切除手术.结果 9例均在单孔后腹腔镜下顺利完成手术.手术时间(121.1±42.3)min,出血量(95.6±60.9)ml.术中无腹膜破裂、大出血、周围脏器损伤,术后无继发出血、切口感染、肠梗阻等并发症.术后4～6 d出院.结论 应用自制多通道套管行单孔后腹腔镜下肾切除手术安全可行、创伤小、切口美观.     

国产钬激光碎石机治疗输尿管结石72例报告

目的探讨应用国产钬激光碎石机治疗输尿管结石的有效性和安全性。方法应用国产钬激光碎石机经输尿管镜治疗输尿管结石72例。男45例,女27例。左侧29例、右侧38例、双侧5例,输尿管上段30例、中下段42例。总结石数86枚,大小3 mm×3 mm～28 mm×22 mm。合并输尿管壁段狭窄5例、合并结石下方息肉形成19例、合并同侧肾积水68例。结果单次手术成功率93%(67/72),其中上段单次手术成功率87%(26/30),中下段98%(41/42)。单次结石粉碎率94%(81/86),其中上段单次结石粉碎率88%(29/33),中下段98%(52/53)。术后住院时间3～10 d,平均(4.7±1.4)d。结石排净时间5～42 d,平均(21.5±10.1)d。术后发生尿路感染1例,无输尿管穿孔、黏膜撕脱、输尿管石街形成、继发血尿等并发症。66例随访3～7个月,结石排净率98%(65/ 66)。结论国产钬激光碎石机经输尿管镜治疗输尿管结石安全可靠、效果佳,值得推广应用。     

深低温停循环下右肾癌切除及下腔静脉癌栓取出术

目的 探讨深低温停循环下右肾癌根治及下腔静脉癌栓(肝上型)取出术方法的可行性.方法1例50岁女性右肾癌伴下腔静脉及右心房癌栓患者行深低温停循环下右肾癌根治及下腔静脉血栓取出术.取胸腹联合正中切口,探查腹腔后,显露右肾、下腔静脉及右肾肾蒂结构.全身肝素化后行升主动脉、上腔静脉、主动脉根部、右上肺静脉插管.经体外循环机降温,降至20℃时停止体外循环.于右肾静脉入口处切开下腔静脉,经下腔静脉插入16 F导管至右心房,充盈气囊,向下拖出癌栓同时切除右肾.缝合下腔静脉切口,恢复体外循环并复温.结果 手术时间330 min,术中生命体征平稳,体外循环时间90 min,深低温停循环时间20 min.术中失血400 ml,输浓缩红细胞6U(机器填充用)及血浆600 ml.患者术后150 min清醒,4 d进食并下床活动,10 d出院.随访6个月未见复发或转移.结论 深低温心脏停搏技术可提高肾癌合并肝上型下腔静脉癌栓手术的有效性和安全性.     

中国人前列腺特异性膜抗原基因的克隆及鉴定

[目的]克隆中国人前列腺特异性膜抗原(prostate specific membrane antigen,PSMA)的cDNA全长,并将其连接到原核表达载体pET-30(a),构建PSMA的原核表达重组子.[方法]从前列腺癌患者活检组织中提取RNA,利用PSMA的cDNA中的EcoR Ⅰ位点,将PSMA分成两段分别做RT-PCR,然后再将其分别连接到pET-30(a)中,从而得到完整PSMA的cDNA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,并对其进行鉴定.[结果]首次成功克隆到全序列的中国人PSMA的cDNA,并构建了PSMA的原核表达重组子pET-30(a)-PSMA,为以后的PSMA表达、纯化及其抗体库的筛选奠定了基础.[结论]分段克隆基因,然后将基因分别连接到同一载体,是有效地对一些长片段基因进行克隆的方法之一.     

膀胱移行细胞癌组织中Survivin、Bcl-2、p53的表达及临床意义

目的探讨膀胱移行细胞癌（BTCC）组织中Survivin、Bel-2、p53的表达及临床意义。方法应用免疫组织化学链酶卵白素-过氧化物酶复合物（sP）方法，检测78例BTCC组织中Survivin、Bel-2、p53的表达，并与15例正常膀胱黏膜组织进行对照研究。结果78例BTCC组织中，Survivin的阳性率为65．4%，Bel-2阳性率为55．1%，p53阳性率为48．7％，而正常膀胱黏膜组织中未见Survivin、p53阳性表达。Survivin、Bcl_2表达与BTCC的病理分级和临床分期显著相关（P〈0．05）。根据Spearman相关分析表明Survivin与Bcl-2、p53表达呈正相关（P〈0．05）。结论Survivin和Bcl-2的高表达提示膀胱癌预后不良，Sttrvivin在BTCC组织中的表达与Bcl-2、p53的异常表达密切相关。