结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6融合基因DNA疫苗株的构建及免疫原性研究

目的构建结核分枝杆菌Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA候选疫苗株并鉴定,初步评价其免疫原性。方法从GenBank中获取M. tuberculosis H37Rv的Ag85B、ESAT6和Hsp65基因序列优化后合成,经PCR、酶切、连接与真核表达载体PVAX1重组,构建重组质粒PVAX1-Hsp65-Ag85B和PVAX1-Hsp65-ESAT6。重组质粒体外转染验证其表达后,免疫C57BL/6小鼠,检测特异性细胞免疫应答反应。结果 Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株在体内外均能表达,Western blot结果显示,DNA疫苗株体外转染293T细胞,24 h可检测到特异性蛋白条带,48 h蛋白表达量达最高。小鼠体内实验表明,Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均可激发较强的免疫反应,可诱导机体产生分泌高水平TNF-α的Th型免疫应答,且Hsp65-Ag85B优于Hsp65-ESAT6。结论 Hsp65-Ag85B、Hsp65-ESAT6 DNA疫苗株均具有较强的免疫原性,呈Th型细胞介导的免疫应答,推测Hsp65-Ag85B DNA疫苗的保护效力优于Hsp65-ESAT6,为新型结核DNA疫苗研制提供了实验依据。     

结核分枝杆菌Ag85B-mRNA疫苗的体外合成及其免疫原性研究

目的体外转录结核分枝杆菌Ag85B-mRNA并评价其免疫原性。方法结合密码子偏好性、GC含量和mRNA二级结构的自由能,优化Ag85B编码区序列,并在其两端插入β球蛋白3’和5’UTR序列。合成目的序列,进行体外转录。经琼脂糖凝胶电泳鉴定正确,体外转染细胞验证其表达后,联合鱼精蛋白免疫Balb/c小鼠,检测特异性细胞免疫应答。结果 Ag85B优化序列二级结构分析显示,其具有更高的稳定性。成功体外合成稳定的Ag85B-mRNA。Western blot检测Ag85B-mRNA转染293T细胞24、48 h,均有清晰特异性的目的蛋白条带。小鼠免疫试验结果显示,Ag85B-mRNA可诱导针对结核分枝杆菌Ag85B分泌高水平IFN-γ的Th1型免疫应答。结论成功体外合成稳定的Ag85B-mRNA疫苗,具有较好的免疫原性,为新型结核疫苗的研制提供新思路。     

重组金黄色葡萄球菌肠毒素B蛋白可溶性微针制备及免疫效果研究

目的建立重组金黄色葡萄球菌肠毒素B(SEB)蛋白的可溶性微针体外检测方法及体内免疫效果评价。方法通过动态光散射(DLS)检测蛋白粒径、BCA法检测单片微针的蛋白浓度、活体成像实验检测微针皮内注射后蛋白在体内的停留时间,通过DRIZE评分评价微针注射后的皮肤情况,通过动物实验评价重组SEB蛋白可溶性微针的免疫原性及免疫保护效果。结果DLS分析显示SEB蛋白可溶性微针负载的重组SEB蛋白粒径与重组SEB蛋白溶液中的SEB蛋白粒径无明显差别,单片微针中重组SEB蛋白含量为(13.2±1.4)μg,活体成像实验显示相对于肌肉注射,重组SEB蛋白可溶性微针皮内给药后荧光蛋白在体内的停留时间延长,动物实验显示13.0μg的重组SEB蛋白可溶性微针即能引发免疫反应,并且在2LD50SEB攻毒剂量下能够产生很好保护效果。结论重组SEB蛋白可溶性微针能够刺激小鼠机体产生较好的免疫原性及免疫保护效果,为发展疫苗新型免疫途径提供了新策略。     

自体血栓性家兔局部脑缺血性梗死模型的建立

目的 介绍一种简单、实用的自体血栓性家兔局部脑缺血性梗死模型.方法 采用家兔自体动脉血栓,经颈外动脉插管栓塞大脑中动脉,造成局部脑缺血性梗死.利用临床观察、2,3,5-氯化三苯基四氮唑(TTC)染色及HE染色评价大脑中动脉闭塞效果及脑组织病理学变化.结果 实验组术后醒来可观察到家兔出现不同程度的偏瘫症状,大脑中动脉阻塞6h以后TTC染色均证实脑梗死存在.HE染色后,光镜观察可见:脑梗死灶的病理变化有随缺血时间延长而加重的现象.对照组未出现以上症状及病变.结论 往家兔颈内动脉导人自体血栓栓塞大脑中动脉,接近临床局灶性脑梗死的发病过程,能够既简便又稳定的建立局灶性脑缺血模型.此模型对研究脑血管病损伤机制和防治措施有着切实临床应用价值.

Abstract：

Objective To establish a convenient method for preparing rabbit models of ischemic cerebral infarction using autologous clot embolism. Methods Ischemic cerebral infarction was induced in rabbits by embolizing the middle cerebral artery using autologous clot emboli. Clinical and histological observations were carried out to evaluate the validity of the animal model. Results Hemiplegia of different severities was observed in the rabbits after the operatioa TTC and HE staining of the brain sections confirmed ischemic cerebral infarction 6 h after obstructing the middle cerebral artery with the autologous clot emboli. Conclusion Embolizing the middle cerebral artery using the autologous emboli is convenient to induce focal ischemic cerebral infarction in rabbits. This model has practical value in the study on the mechanism of ischemic cerebrovascular disease and in developing new strategies for prevention and treatment of the relevant diseases in human.     

两种小鼠胚胎移植方法的比较

目的:通过将传统的撕破囊膜进行小鼠胚胎移植的方法改为囊膜穿刺,以期提高胚胎移植的成功率.方法:共移植ICR和C57BL/6供体小鼠106只,其中改进方法移植47只(ICR小鼠31只,C57BL/6小鼠16只),传统方法移植59只(ICR小鼠39只,C57BL/6小鼠20只).结果:囊膜穿刺方法将输卵管和腹壁的炎性黏连发生率由60%降低到了20%,减轻了对移植后胚胎存活的不利影响,将ICR小鼠和C57BL/6小鼠胚胎移植成功率分别提高到了61%和37%.结论:通过囊膜穿刺进行胚胎移植提高了胚胎移植成功率.     

巨大动脉导管未闭治疗研究进展

动脉导管未闭是最常见的先天性心脏病之一,男女比例约1∶2。由于缺乏认识和延迟诊断等原因,巨大动脉导管未闭患者仍然多见。巨大动脉导管未闭分流可明显降低全身血压,减少流向全身器官的血流量,增加肺血流量和肺血管压力并降低肺顺应性,最终导致不可逆转的肺动脉高压,危及生命。目前关于巨大动脉导管未闭的诊断标准和治疗方法尚无统一共识,为了帮助临床医生了解相关的新进展,现将概述药物、外科手术与介入治疗在巨大动脉导管未闭中的应用。     

加巴喷丁体内外抗RSV感染的作用

目的探讨加巴喷丁对呼吸道合胞病毒(respiratory syncytial virus,RSV)的抗病毒作用。方法体外实验通过MTS、TCID50、q RT-PCR方法检测不同浓度加巴喷丁对RSV感染的抑制作用,包括细胞活力、病毒复制及细胞因子的变化。体内实验选取4~6周龄C57BL/6小鼠,随机分为空白对照组、RSV感染组、低剂量及高剂量加巴喷丁处理组,连续腹腔注射给药,每日观察体质量变化,HE染色观察小鼠肺部的病理变化,q RT-PCR方法检测肺部病毒载量。结果 1、2、5、10 mmol/L不同浓度加巴喷丁显著增加RSV感染A549细胞的活力;5、10 mmol/L浓度的加巴喷丁可显著降低RSV感染A549细胞的病毒载量,10 mmol/L的加巴喷丁可显著抑制病毒的复制,减少CCL3、CCL5、CXCL2及TNF-α、IL-6、IL-8等趋化因子和炎性因子表达,促进干扰素IFN-α、IFN-β表达;动物实验表明90μg、180μg的加巴喷丁处理组可减轻RSV感染小鼠的体质量变化、改善肺部病理损伤和降低病毒载量。结论加巴喷丁可通过抑制病毒复制,调节趋化因子及炎性因子释放,促进干扰素分泌的方式发挥体内抗病毒作用,对RSV感染的C57BL/6小鼠有一定的治疗作用,可改善肺部病理,为进一步临床应用提供实验依据。     

武装GV1001的重组溶瘤流感病毒构建及抗肿瘤作用研究北大核心CSCD

目的拯救嵌合GV1001的重组溶瘤流感病毒株,并通过体内外实验全面评价其选择性杀伤肝癌的效果。方法将编码GV1001肽的碱基序列串联重复3次序列优化设计后插入到A/PuertoRico/8/34(PR8)病毒的NA片段。采用反向遗传学技术,重组质粒pOV-GV1001-NA与pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW197-M、pHW198-NS PR87个质粒共同转染COS 1/MDCK细胞,拯救得到重组溶瘤病毒rOV-GV1001-NA。经过血凝实验、TCID_(50)、PCR、透射电镜、细胞免疫荧光等鉴定,流式细胞术检测rOV-GV1001-NA诱导肝癌细胞死亡的方式,进一步通过肝癌H22细胞小鼠皮下荷瘤模型评价rOV-GV1001-NA体内溶瘤效果。结果重组溶瘤病毒rOV-GV1001-NA血凝效价为2^(9),病毒滴度达5 LogTCID_(50)/ml,并可在SPF鸡胚中稳定传代;电镜观察形态大小符合流感病毒特点;细胞免疫荧光证明GV1001成功插入并表达;细胞凋亡实验表明rOV-GV1001-NA可选择性诱导肝癌细胞凋亡;肝癌小鼠皮下荷瘤模型证实rOV-GV1001-NA可显著抑制肿瘤生长,延长小鼠生存期,且具有剂量依赖性。结论利用反向遗传学技术成功构建了武装GV1001的重组溶瘤流感病毒,体内外实验表明rOV-GV1001-NA能够靶向杀伤肝癌细胞而对正常细胞无明显影响,该结果将为肿瘤疫苗研究提供新思路,有望为肝癌临床治疗开辟新途径。     

重组溶瘤流感病毒靶向杀伤肝癌细胞的实验研究

目的拯救获得重组溶瘤流感病毒株rFlu △ NS/HCC,对其全面鉴定并评价特异性杀伤肝癌细胞的效果。方法利用流感病毒反向遗传学(reverse genetics,RG)技术,以A/Puerto Rico/8/34(PR8)为载体,将NS基因部分敲除,构建重组质粒pFlu △ NS1,与流感病毒PR8的7个质粒pHW191-PB2、pHW192-PB1、pHW193-PA、pHW194-HA、pHW195-NP、pHW196-NA、pHW197-M共转染MDCK和COS-Ⅰ细胞,经拯救、筛选、鉴定获得重组溶瘤流感病毒,命名为rFlu △ NS/HCC。重组溶瘤流感病毒株rFlu △ NS/HCC经SPF鸡胚扩大培养、超滤浓缩、蔗糖密度梯度离心纯化等步骤获得重组病毒,通过血凝试验、RT-PCR、电镜观察病毒形态等方法对rFlu △ NS/HCC进行全面鉴定,并通过MTS细胞活力测定、细胞病变检测评价重组溶瘤流感病毒对不同类型肝癌细胞系的杀伤效果。结果成功拯救重组溶瘤流感病毒rFlu △ NS/HCC,血凝效价为2~(9~10),在HpG2细胞上感染病毒滴度log10TCID50/ml为6.5。MTS和结晶紫染色检测结果显示,重组溶瘤流感病毒rFlu △ NS/HCC感染复数(multiplicity of infection,MOI)≥1时,能够显著降低HepG2细胞活力(P均0.05);MOI≥3时,对SMMC-7721细胞活力影响达显著水平(P均0.05);而不同MOI值的rFlu △ NS/HCC对正常细胞L02无明显影响。结论重组溶瘤流感病毒rFlu △ NS/HCC能靶向杀伤肝癌细胞,有望为临床肝癌靶向治疗提供新的治疗策略。     

肝脏原发性神经内分泌肿瘤研究进展

肝脏原发性神经内分泌肿瘤(primary hepatic neuroendocrine tumors,PHNETs)是一组极其罕见、分化良好的低度恶性肿瘤,其临床特征、实验室检查与影像学结果等缺乏特异性表现.因此,需要在病理诊断的基础上排除其他部位神经内分泌肿瘤肝转移的情况,才能确诊该疾病.目前,PHNETs主要采用以...