联合应用粒细胞集落刺激因子和干细胞因子促进骨髓单个核细胞增殖和动员的实验研究

目的 探讨联合应用粒细胞集落刺激因子(G-CSF)和干细胞因子(SCF)对小鼠骨髓单个核细胞(BM-MNCs)增殖和动员的影响.方法 将昆明种小鼠随机分为4组(n=10):①G-CSF组,皮下注射重组鼠粒细胞集落刺激因子(rmG-CSF)100 μg/(kg·d),连续使用5 d;②SCF组,皮下注射重组鼠干细胞因子(rmSCF)25 μg/(kg·d),连续使用5d;③G-CSF/SCF组,皮下注射rmCrCSF 100μg/(kg·d)和rmSCF 25 μg/(kg·d),连续使用5 d;④空白对照组,皮下注射等剂量的生理盐水.于最后一次注射后6 h取小鼠骨髓,分离培养MNCs,在倒置相差显微镜下观察MNCs的生长情况,用苏木精-伊红常规染色和细胞荧光免疫化学法染色观察MNCs形态.计数成纤维样细胞集落形成单位(CFU-F)的个数;应用流式细胞仪检测MNCs细胞周期及表面抗原特征.结果 G-CSF/SCF组和G-CSF组,CFU-F形成能力显著增强(均P<0.05);并且G-CSF/SCF组的CFU-F计数大于G-CSF组(P<0.05).而SCF组CFU-F计数并没有显著地增加(P0.05).MNCs培养形成的CFU-F,其细胞表面抗原呈CD13+、CD29+、CD90+、CD105+,而不表达CD44.G-CSF/SCF组的MNCs,其G0/G1期细胞百分率较对照组低(P<0.05),而细胞增殖指数(PI)增高(P<0.05),SCF组对MNCs细胞周期的作用与对照组相比差异没有统计学意义(P0.05).结论 G-CSF/SCF可有效地诱导BM-MNCs增殖和动员,且其作用强于单独应用G-CSF.而单独应用小剂量SCF对促进BM-MNCs增殖和动员的作用不明显.     

两种强化股骨头力学结构治疗股骨头坏死临床疗效比较

[目的]比较同种异体骨支撑架/自体松质骨/脱钙骨基质（DBM）与钛合金支撑架/自体松质骨/脱钙骨基质（DBM）分别植入行髓芯减压后的股骨头,强化其力学结构,治疗股骨头坏死的疗效。[方法]2001年1月～2004年8月治疗成人股骨头坏死（FicatⅠ～Ⅲ期）63例（68髋）,在股骨头坏死行髓芯减压后分别植入同种异体骨支撑架/自体松质骨/DBM（A组）和钛合金支撑架/自体松质骨/DBM（B组）,A组32例（34髋）,B组31例（34髋）,分别观察2组病例的手术时间、术中出血量、Harris髋关节评分、X线影像学进展情况及并发症的发生率。[结果]两组所有患者均获得随访,平均随访47个月（24～67个月）,以最后1次随访资料作为最终评价依据。两组在手术时间、术中出血量、Harris评分变化、X线影像学进展情况及并发症的发生率方面均无显著性差异,但两组术后的Harris评分均较术前明显提高,差异有显著性。[结论]同种异体骨支撑架结合自体松质骨和DBM植入治疗成人股骨头坏死,和钛合金支撑架一样能增加股骨头负重区软骨下骨的机械支撑,有利于股骨头坏死的修复与重建。能用同种异体骨支撑架代替钛合金支撑架以加强股骨头软骨下骨的机械强度治疗股骨头坏死。     

同种异体骨支撑架结合自体骨和DBM治疗股骨头坏死的生物力学研究

[目的]研究同种异体骨支撑架结合自体骨和脱钙骨基质（decalcified bone matrix，DBM）植入治疗股骨头坏死生物力学变化。[方法]建立羊双侧股骨头坏死模型，4周后分为4组：单纯行髓芯减压组（A组）、髓芯减压后植入自体松质骨和OSTEOSET^2 DBM组（B组）、髓芯减压后植入同种异体骨支撑架／自体松质骨OSTEOSE^2 DBM组（C组）和正常对照组。术后分别于5、10、20周对股骨头行影像学、组织学观察和生物力学测定。[结果]影像学和组织学检查结果显示C组在髓芯减压区骨缺损修复及成骨方面较B组略高，B、C两组都较同时期的A组明显增强。生物力学测试结果表明，术后5、10、20周时C组力学强度较A、B两组明显增高．差异有统计学意义（P〈0．05），在10、20周时C组股骨头生物力学强度和正常股骨头己无明显差异。[结论]应用同种异体骨支撑架结合自体骨和脱钙骨基质治疗股骨头坏死，能有效加强股骨头的力学结构，促进坏死骨的修复，防止股骨头关节面的塌陷。     

Caspase-3在间质干细胞分化过程中的基因芯片分析及体外作用

目的 观察Caspase-3在小鼠胚胎肢芽间质干细胞分化过程中的作用,并将其运用于体外间质干细胞模型中进行验证.方法 用基因芯片技术检测Caspase-3在小鼠胚胎肢芽间质干细胞分化过程中的基因表达,分析其表达规律和可能作用;Yg用Caspase-3活性检测试剂盒,荧光比色法和Western blot法检测体外培养的骨髓间质干细胞诱导失巢凋亡中Caspme-3活性的改变;借助流式细胞仪分析骨髓间质干细胞凋亡的变化.结果 Caspase-3在小鼠胚胎肢芽间质干细胞向软骨分化的关键期(E12)出现显著的表达下调;Caspase-3的活性以及蛋白表达水平随诱导凋亡时间的延长而明显升高,且与细胞凋亡率相关.结论 Caspase-3蛋白在体内和体外诱导间质干细胞凋亡的过程中均发挥着重要作用;胚胎发育过程中,通过下调Caspase-3的表达以促进软骨形成,而抑制Caspase-3的活性可以有效降低细胞凋亡率.     

Clinical observation of particulate cancellous bone impaction grafting in combination with total hip arthroplasty for acetabular reconstruction

Objective： To investigate the effect of particulate cancellous bone impaction grafting in combination with total hip arthroplasty （THA） for acetabular reconstruction in patients with posttraumatic arthritis and bone loss after acetabular fractures.
Methods： Totally 15 consecutive cases with unilateral acetabular fracture were treated with bone impaction grafting in combination with THA in our department. There were 10 males and 5 females with mean age of 48.2 years （ranging from 36 to 73 years）. Eight cases had the fracture at left hips, 7 at right hips. The average age at injury was 28 years （ranging from 18 to 68 years）. The mean follow-up period was 4.3 years （ranging from 2 to 7 years）. Results： Compared with mean 42 points （ranging from 10 to 62） of the preoperative Harris score, the survival cases at the final follow-up had mean 84 points （ranging from 58 to 98）. One patient had mild pain in the hip. No revision of the acetabular or femoral component was undertaken during the follow-up. Normal rotational centre of most hips was recovered except 2 cases in which it was 0.8 mm higher than that in opposite side. All of them had a stable radiographic appearance. Progressive radiolucent lines were observed in Ⅰ,Ⅲ zones in 2 cases. One patient had a nonprogressive radiolucent line in zone Ⅲ. The cup prosthesis was obviously displaced （6 mm） in one patient, but had not been revised.
Conclusion： Particulate cancellous bone impaction grafting in combination with THA as a biological solution is an attractive procedure for acetabular reconstruction in patients with posttraumatic arthritis and bone loss after acetabular fracture, which can not only restore acetabular bone stock but also repair normal hip anatomy and its function.     

术中三维影像脊柱导航引导半椎体切除及椎弓根螺钉置入矫治儿童先天性脊柱侧后凸畸形

目的:探讨术中实时三维影像脊柱导航引导下后路椎弓根螺钉置入及半椎体切除矫治儿童先天性脊柱侧后凸畸形的临床疗效。方法:自2010年5月~2013年4月,对18例儿童先天性半椎体脊柱侧后凸畸形患者进行术中实时三维影像脊柱导航引导下进行脊柱矫形手术。其中,男7例,女11例,年龄7.6±2.9岁。术中在实时三维影像脊柱导航引导下经后路置入椎弓根螺钉并切除半椎体后进行矫形。术后通过CT评价椎弓根螺钉位置及半椎体切除情况,术前、术后摄脊柱正侧位X线片,评价矫形效果。结果:手术时间216±55min,术中出血量732±378ml。18例患者共置入椎弓根螺钉127枚(4~12枚/例)。术后CT证实124枚椎弓根螺钉位置准确,置钉准确率97.6%;1枚椎弓根螺钉穿破椎弓根内侧皮质,2枚椎弓根螺钉穿破椎弓根外侧皮质。1例出现椎弓根螺钉切割,1例出现血气胸,置入胸腔闭式引流。无神经损伤并发症病例,无螺钉误置而引起的并发症。术后CT证实18例患者半椎体均完整切除。18例中有16例获得随访,随访时间18.5±8.0个月。16例术前测量冠状面节段性侧凸Cobb角44.5°±11.4°,术后为9.3°±4.7°,末次随访时为9.7°±5.0°,矫正率为(78.2±7.8)%。节段性后凸Cobb角术前测量为32.2°±7.3°,术后为7.2°±3.5°,末次随访节时为7.7°±3.9°,矫正率为(76±9.4)%。侧凸及后凸矫正与术前相比均有统计学意义(P0.01)。末次随访时16例患者均获得骨性融合。结论:术中实时三维影像脊柱导航引导经后路矫治先天性脊柱侧后凸畸形半椎体切除完整,置入椎弓根螺钉准确率高,安全性高,畸形矫正效果满意。     

转化生长因子-β3融合蛋白促进骨髓基质干细胞向软骨分化的研究

目的 构建潜在相关肽(LAP)为潜伏位点,基质金属蛋白酶(MMP)切位点为导向位点,转化生长因子(TGF)-β3活性部分(mTGF-β3)为治疗位点的具有靶向治疗作用的新型TGF-β3融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3,并转染大鼠来源的骨髓基质干细胞(MSCs),并检验其特异性的靶向治疗作用.方法 将人工合成的编码MMP酶切位点氨基酸的正反义DNA序列经基因重组定向克隆插入真核表达载体pIRES-EGFP中,获得pIRES-EGFP-MMP重组体,用逆转录-聚合酶链反应(RT-PCR)从大鼠胚胎组织中获取TGF-β3的LAP(781 bp)段和TGF-β3的活性片段mTGF-β3(313bp),分别插入pIRES-EGFP-MMP中MMP的上游和下游,获得pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3重组质粒.然后将其转染入大鼠来源的MSCs,将转染后的MSCs在有MMP-1和无MMP-1的条件下进行球团培养,分别于第7、14、21天检测胶原2(COLⅡ),Aggrecan(Agc)和TIPM的表达.结果 经过测序和酶切鉴定,构建pIRES-EGFP-LAP-MMP-mTGF-β3质粒;转染MSCs后,我们成功获得了LAP-MMP-mTGF-β3融合蛋白(39 kDa)的表达,并验证了其只有在MMP酶环境中才能被激活生成具有生物学效应的特异性的mTGF-β3二聚体(22.2 kDa);球团培养中,MMP酶存在的条件下第21天COLⅡ、Agc、TIPM的相对表达量分别为1.45±0.07、1.61±0.09、1.80±0.08,无MMP酶存在的条件下第21天COLⅡ、Agc、TIPM的相对表达量分别为0.42±0.09、0.38±0.15、0.27±0.07.结论 构建了一种新型具有靶向治疗作用的融合蛋白LAP-MMP-mTGF-β3.     

老年骨关节炎患者软骨组织的基因芯片分析

目的观察老年骨关节炎(OA)患者软骨组织中细胞凋亡相关基因表达的差异,探讨相关基因与OA导致的软骨退变之间的关系。方法选择老年OA患者5例及对照者5例,应用基因芯片技术检测所获取的软骨组织中细胞凋亡相关基因的差异表达,并进行基因表达通路查询。结果与正常对照者相比,老年OA患者软骨组织中共有11个与细胞凋亡相关基因出现显著差异表达,其中IL-1、TNF-α、IGF、SMPD1及MMP-1表达上调,这些基因主要涉及MAPK信号通路。结论与免疫相关的多个基因的差异表达可能是老年人OA软骨退变发生的关键因素。     

缝隙连接阻断剂1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞体软骨分化的影响

[目的]研究缝隙连接阻断剂1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞体外软骨分化的影响。[方法]体外培养小鼠骨髓基质干细胞(MSCs),贴壁细胞传代,取第3代细胞,以生长分化因子-5(GDF-5)(100ng/ml)和1-庚醇(2.5μmol/L)干预培养后,MTT法测定1-庚醇对小鼠骨髓基质干细胞增殖的影响,RT-PCR和免疫细胞化学法检测Ⅱ型胶原的表达,Westernblotting检测Cx43蛋白的表达,阿尔辛蓝(Alcian)染色蛋白多糖。[结果]MTT结果显示2.5μmol/L浓度1-庚醇对小鼠MSCs的增殖不产生影响,对细胞没有毒性抑制作用;RT-PCR和免疫细胞化学显示1-庚醇能够抑制Ⅱ型胶原mRNA和蛋白的表达;Alcian染色结果显示1-庚醇抑制分化细胞分泌蛋白多糖基质;Western blotting结果表明1-庚醇对Cx43蛋白的表达没有作用。[结论]GDF-5能够定向诱导小鼠骨髓基质干细胞向软骨方向分化,Cx43蛋白介导的缝隙连接细胞间通讯在GDF-5诱导软骨分化中发挥着很重要的作用。     

转铁蛋白-多聚乙烯亚胺体外转染小鼠骨肉瘤细胞的实验研究

目的评价转铁蛋白-多聚乙烯亚胺(transferrin-polyethylenimine,Tf-PEI)靶向性转染小鼠骨肉瘤细胞的可行性,并确定最佳的转染条件.方法以Tf-PEI为载体,将绿色荧光蛋白基因和荧光素酶基因分别导入小鼠骨肉瘤细胞,用荧光显微镜及荧光素酶检测系统检测其转染效率.以游离转铁蛋白竞争性拮抗Tf-PEI,并观察它对转染效率的影响.结果Tf-PEI可以高效的、靶向性的转染小鼠骨肉瘤细胞.当N/P比值为5时,Tf-PEI的转染效率最高.游离转铁蛋白能够显著的拮抗Tf-PEI的转染.结论Tf-PEI是一种高效率、低毒性、肿瘤靶向性的基因转染载体,它可以作为体外恶性肿瘤基因治疗试验的一个有效工具.