血管内皮生长因子在原核细胞中的活性检测

背景：目前血管内皮细胞生长因子制备困难，来源有限，限制了临床的应用。目的：用基因工程的方法在大肠杆菌中诱导表达人血管内皮生长因子165，分离纯化并检测其免疫学以及生物学活性。为后期构建携带血管内皮生长因子165蛋白的预成血管化组织工程骨提供了充足的蛋白来源。设计、时间及地点：开放性实验，单一样本观察，于2005-04／2007-01在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成。材料：携带目的基因血管内皮生长因子165的克隆质粒PUC18-VEGF165由西安交通大学第二医院时志斌博士构建，PGEM-Teasy质粒购自美国Promerga公司，原核表达质粒购自德国Qiagen公司，DH5o、M15、JM109菌株由陕西省疾病预防控制中心病毒研究室保存。方法：利用聚合酶链反应亚克隆的方法获得目的基因片段，构建表达质粒pQE30-VEGF165，在大肠杆菌JM109中用IPTG进行诱导表达并使用Ni2＋NTA进行蛋白纯化。经过纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白。主要观察指标：①人血管内皮生长因子165基因的亚克隆结果。②重组表达载体pQE30-hVEGF165的鉴定结果。③人血管内皮生长因子165蛋白的诱导表达、纯化。④使用ELISA和Western blot技术检测人血管内皮生长因子165蛋白免疫学活性。⑤鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验检测其生物学活性。结果：重组表达质粒pQE30-VEGF165在大肠杆菌中成功地表达了相对分子质量为23000的蛋白，其以不溶性的包涵体形式存在，占菌体蛋白的30％左右，经过分离和Ni柱纯化获得了血管内皮生长因子165蛋白，浓度约为0．2g／L，ELISA和Western blot实验显示其具有良好的免疫学活性，鸡胚尿囊绒毛膜试验和matrigel血管形成实验显示表达蛋白具有良好的生物学活性。结论：实验在原核细胞中稳定、高效表达了具有活性的血管内皮生长因子165蛋白，为后期预构血管化组织工程骨的构建提供了充足的蛋白来源。     

室性并行灶周围隐性折返伴显性折返性室性心动过速

患儿女,6岁。临床诊断:病毒性心肌炎。入院时Ⅱ导联连续描记(附图)示窦性P-P间期0.48—0.62s,频率97—125次/min,P-R间期0.12s。QRS波群呈3种形态:(1)窦性心律,呈RS型,时间仅0.06s,如上行R_(2、3、5、7、8、10、11、13、14),中行R_(1、3、5),下行R_(9—16);(2)室性期前收缩,呈R型,时间0.14—0.16s,如上行R_15,中行R_(2,4、6—17),下行R_1—8、17);(3)介于前两者之间的室性融合波群,呈R型,时间0.06—0.12s,如上行R_(1、4、6、9、12其形态差异较大,是由室性期前收     

关节置换与内固定治疗转子问骨折并发症的对比研究

目的探讨关节置换与内固定治疗转子间骨折患者1年内的死亡率、并发症的差异。方法自2005年10月至2010年10月共162例（162髋）转子间骨折,进行术后1年的随访,由于患者原因造成35例失访,按要求完成随访的患者共127例（127髋）;其中动力髋螺钉（DHS）44例、股骨近端髓内钉（PFN）40例、半髋关节置换43例。比较各组患者术后1年内的死亡率、并发症的发生率及疗效。结果三组在手术时间和术中出血量上差别有统计学意义,其中关节置换组的手术时间和术中出血量最少。按Harris评分系统评估,各组优良率分别是77.3%（DHS组）、77.5%（PFN组）、95.3%（关节置换组）;三组间的优良率差异有统计学意义（χ2=6.654,P〈0.05）,其中关节置换组的优良率最高。术后1年内的死亡率为18%（DHS组）、11%（PFN组）、2%（关节置换组）;三组间差异没有统计学意义（χ2=3.805,P〉0.05）;术后1年内并发症的发生率为38.6%（DHS组）、17.5%（PFN组）、13.9%（关节置换组）;三组间差异有统计学意义（χ2=8.557,P〈0.05）,其中关节置换组的并发症发生率最低。结论对于转子间骨折,半髋关节置换在术后1年时是明显优于内固定的。     

室性期前收缩伴折返径路内的交替性反文氏周期2例

例１患者男性 ,２１岁。因发热、咳嗽１周 ,胸闷、心悸３天就诊。体检 :ＢＰ１５／１０ｋＰａ(１１２／７５ｍｍＨｇ) ,心率９０次／ｍｉｎ ,心律不齐 ,各瓣膜区未闻及病理性杂音。彩色超声心动描记术检查未见异常。临床诊断 :病毒性心肌炎。心电图Ｖ６导联连续描记 (图１)示窦性心律 ,略有不齐 ,频率８３～１００次／ｍｉｎ ,Ｐ＿Ｒ间期０．１６ｓ,可见频发室性期前收缩以隐匿性期前收缩二联律形式出现 ,其联律间期不等 (０．４８～０．５６ｓ) ,且有规律可循 ,即由长逐渐缩短 ,直至室性期前收缩缺失 ,然后再重复出现。短室性期前收缩间期…     

不同氨甲环酸给药途径在全膝关节置换术的有效性和安全性

目的探讨氨甲环酸(TXA)不同给药途径(局部、静脉以及局部静脉联合)减少初次膝关节置换术后出血量方面的安全性及有效性。 方法选取2015年9月至2017年12月在西安交通大学第二附属医院骨一科因重度骨关节炎初次行单侧全膝关节置换术、无TXA使用禁忌的患者共计159例;排除术前存在深静脉血栓DVT、凝血功能异常、术前正使用抗凝药物、术前血红蛋白<100 g/L、伴有恶性肿瘤、伴有或曾发生心肌梗死和脑梗死的患者、伴有出血性疾病者、严重肝肾功能不全者。分为A、B、C、D 4组,A组给予关节腔注射生理盐水100 ml,B组给予关节腔注射氨甲环酸1 g,C组术前30 min给予静脉滴注氨甲环酸1 g,D组术前30 min静脉滴注氨甲环酸1 g ＋关闭关节囊后关节腔注射氨甲环酸1 g。记录患者术后凝血系列、显性失血量,并计算隐性失血量、总失血量、深静脉血栓发生率和输血率。计数资料使用χ²检验,组间相关测量指标比较使用方差分析。 结果术前、术后1 d、3 d和7 d,同一时间点比较各组患者的凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)和纤维蛋白原含量无明显差异。4组术后深静脉血栓的发生率分别为10.53%、11.11%、13.64%和13.51%,差异无统计学意义(χ²＝0.961,P >0.05)。B组、C组和D组的显性失血量、隐性失血量和总失血量都明显低于A组(P <0.05),D组的显性失血量和总失血量明显低于B组和C组(P <0.05),而B组和C组的显性失血量、隐性失血量和总失血量均无明显差异(P >0.05)。A、B、C、D 4组的输血率分别为21.05%,6.67%、4.76%和2.94%,B组、C组和D组的输血率明显低于A组(χ² ＝9.914,P <0.05)。 结论氨甲环酸局部应用、静脉滴注以及二者联合应用均能有效减少全膝关节置换术后患者的失血量并降低输血率,而不增加术后深静脉血栓的发生率。静脉联合关节腔注射减少术后失血量的效果优于单独使用。     

宽QRS波心动过速的诊断及鉴别诊断

宽QRS波心动过速（WRT）是指WRT发作时心室率大于或等T-100次／分，QRS波时限大于或等于0．12秒的心动过速，是需急诊鉴别与处理的快速心律失常。是临床上常见的又为临床医师及心电图工作者感到颇为头疼的心律失常。鉴于用来治疗室上性心动过速的常用药物，如洋地黄、维拉帕米、地尔硫卓等常可使事性心动过速恶化，故宽QRS波心，动过速的诊断及鉴别诊断至关重要。     

复合骨折血肿人工骨成骨能力的实验研究

目的通过实验研究观察复合骨折血肿人工骨的成骨能力。方法选取骨骼成熟的健康成年新西兰兔共48只,完全随机(随机数法)分为A、B、C、D组,每组12只。手术造成髂骨骨折,形成骨折块。A组将β-TCP支架置于骨折块外侧,于术后第4天取出附有血肿的支架材料植入对侧背阔肌下;B组造成骨折后缝合伤口,并直接将β-TCP支架植入背阔肌下;C组在骨折后缝合切口,4 d后再次切开,将骨折块植入背阔肌下;D组在造成骨折后直接取下骨折块植入背阔肌下。4周和8周后分批处死动物进行病理观察,定量分析新骨形成量。结果第4周,A组新生骨组织面积分数高于B、D组,但低于C组,差异有统计学意义(P0.05)。第8周时,A组新生骨组织面积分数仍高于B、D组,差异有统计学意义(P0.05);但与C组间差异无统计学意义(P0.05)。A、C组新生骨的面积随时间延长而逐渐增加,差异有统计学意义(P0.05);而B、D组术后第4、8周新生骨组织面积差异无统计学意义(P0.05)。结论人工骨复合骨折血肿的方法可以明显提高其成骨能力,可以形成成骨能力优于自体髂骨的移植材料。     

Lck-Cre×Perp^flox/flox条件敲除小鼠的繁育及基因型鉴定

目的 制备Cre-LoxP重组酶系统调控下的T淋巴细胞Perp基因条件性敲除的纯合子小鼠并进行鉴定,为进一步在整体动物水平研究Perp基因在T细胞发育以及在自身免疫疾病发病中的作用提供研究平台.方法 将引进的Perp条件敲除小鼠和T淋巴细胞特异性表达Cre重组酶的Lck-Cre小鼠分别进行繁殖和鉴定,然后将两种小鼠进行杂交并对其子代小鼠的基因型进行鉴定,其子代基因型为Lck-Cre×Perpflox/flox的小鼠即为本实验所构建的T细胞Perp基因特异性敲除的纯合子小鼠.结果 Lck-Cre×Perp^flox/flox的纯合子小鼠被繁殖成功并准确鉴定.Lck-Cre×Perp^flox/flox小鼠脾脏CD3-细胞的Perp基因的RNA及蛋白表达水平与Lck-Cre×Perp^＋/＋小鼠相比显著降低.结论 本研究利用Cre-LoxP技术成功构建了T细胞特异性敲除Perp基因的纯合子小鼠,为进一步研究Perp基因在T淋巴细胞发育以及自身免疫性疾病发病中的作用提供了优良的工具.     

人血管内皮生长因子与绿色荧光蛋白标记双基因共表达AAV载体的构建及鉴定

背景:血管内皮生长因子能促进内皮细胞分裂增殖及血运重建,诱导血管生成,近年来以血管内皮生长因子为基础的基因治疗已逐步试用于临床.但质粒载体转染率低、腺病毒载体对机体的免疫原性及存在潜在感染危险等问题尚需探讨.目的:拟构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒,鉴定并测定病毒滴度及活性.设计、时间和地点:开放性实验,于2007-03/09在陕西省疾病预防控制中心病毒室完成.材料:病毒包装细胞AAV-293、病毒滴度检测细胞AAV-HT1080购自Stratagene公司;Ecoli DH5.菌株由陕西省疾病预防控制中心保存:AAV helper-free system腺相关病毒包装系统中pAAV-IRES-hrGFP质粒包含绿色荧光报告基因,购自Stratagene公司;重组携带hVEGF165基因的质粒pUC18-hVEGF165由西安交通大学第二医院骨科时志斌博士构建.方法: 从含有hVEGF165基因的pUC18-hVEGF165质粒中扩增出hVEGF165片段,插入腺相关病毒骨架质粒pAAV-IRES-hrGFP,构建重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP.将此重组质粒和腺相关病毒包装质粒pAAV-RC、辅助质粒pAAV-Helper磷酸钙法共转染AAV-293细胞,通过同源重组产生重组腺相关病毒rAAV-hVEGF165-GFP.荧光显微镜下监测病毒包装效率,裂解AAV_293细胞收获重组病毒并进行浓缩纯化.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞,荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.应用该重组病毒感染AAV-HT1080细胞.主要观察指标:荧光显微镜下监测病毒包装效率.荧光计数法测定病毒滴度,并通过病毒基因组外源基因hVEGF165扩增鉴定重组病毒的包装是否成功.结果:扩增产物经DNA测序确定为hVEGF165 cDNA片段,重组骨架质粒pAAV-hVEGF165-IRES-hrGFP经双酶切鉴定正确.病毒包装效率达95%以上,收获纯化病毒滴度达5.5×1011vg/mL.提取重组病毒基因组成功扩增出外源目的基因片段hVEGF165,证实重组病毒rAAV-VEGF165-GFP包装成功.结论:成功构建带有绿色荧光蛋白标记并携带hVEGF165基因的无致病性重组腺相关病毒rAAV-VEGF165-GFP.收获的病毒具有较高滴度和感染活性.