血管紧张素Ⅱ对肝星状细胞基因表达的影响

目的观察血管紧张素Ⅱ对培养肝星状细胞(HSC)株LX2细胞基因表达的影响。方法以1×10~(-5)mol/L的血管紧张素Ⅱ与LX2细胞孵育48 h,对照组不加血管紧张素Ⅱ。收集实验组和对照组细胞,分别提取mRNA及总蛋白质,进行抑制性消减杂交和蛋白质双向电泳及质谱分析。结果抑制性消减杂交产物经两轮聚合酶链反应(PCR)扩增,结果显示为200～1000 bp大小不等的插入片段,挑选36个克隆测序,应用生物信息学技术分析,发现13个克隆与未知基因序列高度同源,其中GenBank号为BC097361、BC057380的基因为具有开放读码框架的完整基因。其余23个克隆均与已知基因的部分序列高度同源(98%～100%),主要相关基因包括β肌动蛋白、亮氨酰tRNA合成酶、基础免疫球蛋白2、丙酮酸激酶,过氧化物酶1、人类白细胞抗原-B关联转录物3等。在血管紧张素Ⅱ孵育的和阴性对照HSC的双向电泳图谱中分别探测到1110、1008个点,两个图谱有504个点匹配。其中108个点和对照相比明显上调(容积比＞1．5),153个点和对照相比明显下调(容积比＜0．67),选取其中相对容积上调的10对点进行质谱分析,其中8个点在数据库中检索得到相应结果,分别为抑素、电子转移黄索蛋白亚单位、超氧化物歧化酶2、三磷酸核苷酶等。结论血管紧张素Ⅱ处理后的HSC mRNA表达上调具有增殖加速、凋亡抑制和促进分化等生物学作用,部分上调蛋白质为细胞内信号传导蛋白质、代谢调控蛋白质、细胞凋亡抑制蛋白质以及纤维化相关调控蛋白质。     

乙型肝炎病毒胎盘垂直传播的机制

目的 研究胎盘组织中HBV感染与胎儿宫内感染的关系.方法 携带HBshg的孕妇,血清HBV DNA阴性12例:血清HBV DNA阳性19例;血清HBV DNA阳性,孕晚期拉米夫定治疗16例;血清HBV DNA阳性,孕晚期免疫球蛋白(HBIG)治疗19例.使用免疫组化与原位聚合酶链反应(In situ polvmerase chain reaction,IS PCR),检测胎盘组织中的HBcAg与乙型肝炎共价环状DNA(HBV covalently closed circular DNA,HBV cccDNA).结果 胎盘绒毛炎发生率与婴儿发生宫内感染率具有明显相关性(P＞0.05);胎盘HBcAg的感染率与婴儿发生宫内感染率之间具有明显的相关性(P＞0.05);治疗后,胎盘HBVccc DNA感染与婴儿发生宫内感染没有显著差异性(P＞0.05).结论 胎盘组织发生炎症,使部分绒毛发生纤维素样坏死,胎盘屏障受损,通透性增加,HBV易通过胎盘屏障感染胎儿;HBcAg在胎盘中的表达,表明HBV感染与复制,是导致宫内感染的危险因素;阻断治疗可能抑制了感染胎盘组织cccDNA复制,使宫内感染的危险性降低.     

XTP3基因融合蛋白的表达纯化及多克隆抗体制备

目的构建稳定表达乙肝病毒XTP3蛋白的原核表达载体并在大肠埃希菌中诱导融合蛋白的表达,制备兔抗XTP3蛋白多克隆抗体并检测该抗体在乙肝肝癌、正常肝组织中的作用效果。方法PCR获得XTP3基因片段,插入至pET-32a( )中构建原核表达载体pET-32a( )-XTP3,测序正确后转化大肠埃希菌BL21,IPTG诱导表达。SDS-PAGE、Western blotting分析鉴定融合蛋白的表达。利用Ni 亲和柱对表达蛋白进行纯化及柱上复性。免疫新西兰兔,制备多克隆抗体并进行ELISA、Western blotting及免疫组化验证。结果成功构建pET-32a( )-XTP3表达载体并在大肠埃希菌中诱导出高水平表达的XTP3融合蛋白,目的蛋白分子量为52kD,SDS-PAGE分析表明为包涵体表达。经亲和树脂纯化后免疫新西兰兔,成功获得融合蛋白及兔抗XTP3多克隆抗体。ELISA检测证明多克隆抗体效价>1:128000。免疫组化证实本实验中XTP3多克隆抗体在肝癌组织中的表达呈明显的细胞膜阳性,特异性良好。结论成功表达、纯化了XTP3基因融合蛋白,获得高特异性、高效价兔抗XTP3多克隆抗体,为进一步研究XTP3蛋白的生物学特性奠定了基础。     

抑制性消减杂交技术筛选γ-氨基丁酸调节的肝星状细胞系靶基因

目的:应用抑制性消减杂交技术(SSH)筛选γ-氨基丁酸(GABA)作用肝星状细胞系HSC-T6后的差异表达基因.方法:10 umol/L的GABA作用于HSC-T6细胞24 h,提取mRNA,用分光光度计进行定量分析.以GABA处理和未处理的T6细胞mRNA为模板逆转录合成双链cDNA(dscDNA),并分别标记为Tester和Drivet,酶切后与接头连接,经两次杂交,构建消减杂交文库,将消减文库的扩增产物进行转化、克隆分析后应用生物信息学技术将测得序列再进行同源性分析.结果:15种基因表达上调,其中包括与DNA合成、线粒体、肿瘤抑制以及凋亡相关的4类基因,结果显示GABA可能促进HSC-T6细胞增殖而抑制凋亡.结论:用SSH技术可以成功获得GABA刺激肝星状细胞基因上调的监测,证明GABA能够影响肝星状细胞的基因表达谱.     

注射用血栓通对肝星状细胞基因表达的影响

目的:探讨注射用血栓通对肝星状细胞 LX02基因表达的影响及其机制.方法:将103 mg/L的注射用血栓通与人肝星状细胞 LX02 共同孵育 48 h,提取 mRNA,并逆转录成cDNA.与芯片杂交,根据杂交信号强弱筛选相关基因.结果:41 条肝星状细胞基因差异表达,其中表达上调的基因21条,下调基因20条,这些基因主要与能量代谢、细胞黏附、DNA结合、磷酸化、甲基化等相关,还有部分基因功能不详.结论:经注射用血栓通作用后,肝星状细胞基因表达发生变化,其可能通过调控这些基因的表达实现了对肝星状细胞功能的抑制作用.     

新型冠状病毒VSV假病毒的 构建及其感染能力的初步研究

摘要]?目的?在二级生物安全实验室条件下,通过构建新型冠状病毒（新冠病毒）VSV假病毒,研究新冠病毒及其流行变异株的侵入特性。方法?通过购买的新冠病毒（Wuhan-Hu-1株）VSV-luc假病毒构建VSV-G/VSV-ΔG-luc假病毒;利用VSV-G/VSV-ΔG-luc假病毒构建新冠病毒VSV假病毒。通过分子克隆对新冠病毒S基因相应位点进行突变,构建新冠病毒不同变异株的刺突蛋白表达质粒,由此包装出新冠病毒各种变异株假病毒。比较新冠病毒Wuhan-Hu-1株与D614G株、Delta株在不同细胞系中的感染能力。 结果?新冠病毒VSV假病毒构建成功。评价新型冠状病毒Wuhan-Hu-1株、D614G株、Delta株在4种不同细胞系中侵入情况,与Wuhan-Hu-1株相比,D614G株和Delta株的感染水平均明显增加（P均＜ 0.05）,同时在Calu-3和Caco-2细胞系中,Delta株的感染水平明显强于D614G株（P均＜0.05）。利用模拟细胞-细胞间传播的感染试验发现,Delta株感染HEK-293T细胞与Vero细胞的能力明显高于D614G株（P均＜0.05）。 结论?新冠病毒Delta株的感染能力明显强于Wuhan-Hu-1株和D614G株。VSV假病毒系统能够模拟、替代新冠病毒活病毒在侵入细胞的过程中的生理功能,并且安全可靠、易于量化、应用广泛,在新冠病毒研究领域中能够发挥重要作用　　 摘要]?目的?在二级生物安全实验室条件下,通过构建新型冠状病毒（新冠病毒）VSV假病毒,研究新冠病毒及其流行变异株的侵入特性。方法?通过购买的新冠病毒（Wuhan-Hu-1株）VSV-luc假病毒构建VSV-G/VSV-ΔG-luc假病毒;利用VSV-G/VSV-ΔG-luc假病毒构建新冠病毒VSV假病毒。通过分子克隆对新冠病毒S基因相应位点进行突变,构建新冠病毒不同变异株的刺突蛋白表达质粒,由此包装出新冠病毒各种变异株假病毒。比较新冠病毒Wuhan-Hu-1株与D614G株、Delta株在不同细胞系中的感染能力。 结果?新冠病毒VSV假病毒构建成功。评价新型冠状病毒Wuhan-Hu-1株、D614G株、Delta株在4种不同细胞系中侵入情况,与Wuhan-Hu-1株相比,D614G株和Delta株的感染水平均明显增加（P均＜ 0.05）,同时在Calu-3和Caco-2细胞系中,Delta株的感染水平明显强于D614G株（P均＜0.05）。利用模拟细胞-细胞间传播的感染试验发现,Delta株感染HEK-293T细胞与Vero细胞的能力明显高于D614G株（P均＜0.05）。 结论?新冠病毒Delta株的感染能力明显强于Wuhan-Hu-1株和D614G株。VSV假病毒系统能够模拟、替代新冠病毒活病毒在侵入细胞的过程中的生理功能,并且安全可靠、易于量化、应用广泛,在新冠病毒研究领域中能够发挥重要作用     

酵母双杂交技术对人胰腺cDNA文库中HBcAg结合蛋白基因的筛选

目的: 应用酵母双杂交技术,筛选人胰腺cDNA文库中与HBV核心抗原结合的蛋白的基因.方法:扩增人胰腺cDNA文库并纯化鉴定,将其转化至酵母菌Y187;诱饵质粒pGBKT7-HbcAg转化酵母菌AH109并筛选鉴定.应用酵母双杂交系统3进行配合,在SD/-Trp/Leu-His/-Ade培养基和含X-gal的SD/-Trp/-Leu/-His/-Ade培养基上进行双重筛选,提取阳性酵母菌落的质粒转化大肠埃希菌DH5α,提取质粒并测序,对测序结果进行生物信息学分析.结果:人胰腺cDNA文库的构建以及pGBKT7-HBcAg质粒转化AH109酵母菌株均获成功,并从人胰腺cDNA文库中筛选出9个与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因.分别与以下已知的9种编码蛋白基因序列同源:人胰脂肪酶(PNLIP)、人胆盐刺激酯酶(CEL)、人胰凝乳蛋白C(CTRC)、人胰蛋白酶原、人羧肽酶B1(CPB1)、人线粒体全基因组、人胰弹性酶2A、人辅脂肪酶(CLPS)和人核糖体蛋白(RPL10A).结论:筛选出的与HBcAg蛋白相结合的蛋白基因主要与胰腺外分泌功能相关,HBV感染可能通过与胰腺所分泌的糖、脂类代谢相关的酶类结合,而引发代谢性疾病.     

三肽化合物酪丝缬肽对人肝癌BEL-7402细胞增殖抑制作用的实验研究

目的观察三肽化合物酪丝缬肽(tyroservaltide,YSV)对体外培养人肝癌BEL7402细胞增殖的抑制作用。方法建立人肝癌BEL7402及Chang氏肝细胞体外培养体系,用BrdU法、MTT法及LDH法,观察YSV对体外培养的BEL7402细胞、Chang氏肝细胞DNA分裂指数、MTT代谢率、LDH释放量的影响,用琼脂糖凝胶电泳观察药物对体外培养BEL7402细胞DNA片段化的影响。结果YSV对BEL7402细胞作用48h、72h时药物浓度为1mg·L-1和0.1mg·L-1组与阴性对照组比较:①能显著抑制肿瘤细胞DNA的合成(P<0.01),抑制率最高为药物浓度1mg·L-1作用72h时可达32.53%,②能表现出明显抑制细胞代谢的作用(P<0.05)其中YSV0.1mg·L-1作用72h时抑制率最高为19.12%,③能增加胞浆内LDH的释放(P<0.05),YSV(1mg·L-1)作用72h时抑制率最高,为36.13%,④能诱导BEL7402肝癌细胞DNA片断化成低分子量DNA,经1%琼脂糖电泳后显示为DNALadder。对正常肝细胞系Chang氏肝仅0.1mg·L-1在48h表现出抑制DNA合成能力的作用。结论YSV抑制人肝癌BEL7402细胞的增殖,对正常肝细胞系Chang氏肝没有影响。     

丙型肝炎病毒核心蛋白与其结合蛋白HCBP12在HepG2细胞中的相互作用

目的：使用哺乳动物双杂交系统探讨HCV—core与HCBP12在人肝癌细胞HepG2细胞中的相互作用．方法：PCR分别扩增含HCV core及HCBP12的cDNA片段，克隆人pGEM—T载体，经测序正确后再分别克隆入哺乳动物双杂交的表达质粒PBIND和PACT中，并转染HepG2细胞，48h后检测细胞中报告基因luciferase activity的表达水平．结果：Dual-Luciferase Activety系统检测显示PBIND-core与PACT-HCBP12实验组萤火虫荧光与海肾素荧光的比值明显高于其他阴性对照组，但低于阳性对照组．结论：哺乳动物双杂交系统证实HCV核心蛋白与其结合蛋白HCBP12在人肝癌细胞系中HepG2中有一定的相互作用，为进一步研究HCV-core和HCBP12的功能奠定基础．     

γ-氨基丁酸对人肝细胞株基因表达的影响

目的:观察γ-氨基丁酸(GABA)对人肝细胞株Huh-7基因表达的影响.方法:将10μmol/L GABA与Huh-7细胞共同孵育24h,以PBS处理的Huh-7细胞为对照,提取mRNA,并逆转录成cDNA.与芯片杂交,根据杂交信号强弱筛选相关基因.结果:共筛选出27条差异表达的基因,其中11条基因表达下调,16奈基因表达上调,这些基因主要是与细胞增殖、凋亡及免疫功能相关,另外还有部分基因功能不详.结论:GABA对肝细胞基因表达谱有一定作用,GABA可能参与肝细胞功能的调控.