感染冠状病毒的大鼠胸腺组织超微结构观察

目的 通过对感染大鼠冠状病毒(rat coronavirus，RCV)的大鼠胸腺组织进行超微结构的研究。阐明RCV在细胞内形成的形态学机制。方法 用在进行自噬性形态学研究中的Wistar大鼠做模型，常规电镜取材、固定、包埋、切片和观察。结果 胸腺上皮细胞的胞质内出现大小不等的内质网池，并相互融合形成巨大的内质网湖。湖内充满RCV颗粒，称为病毒包涵体。病毒在内质网囊壁上通过出芽方式进人内质网湖基质，发育为成熟的RCV，最终排出于细胞外。病毒颗粒呈圆形，直径约100～130nm。病毒胞浆成均质状，病毒的膜蛋白有二层，外层为包膜，内层为核衣壳。包膜与核衣壳之间为低电子密度的中间层，其内有时可见1～2层较薄的膜样结构。钉突成放射状贯穿包膜，其内侧端连于核衣壳．外侧端膨大，由一层絮状的糖蛋白包绕，形成日冕状。病毒颗粒分布在胸腺上皮细胞的内质网湖、胞浆、内吞体／溶酶体以及胸腺上皮细胞间，溶酶体内的病毒无包膜和核衣壳。结论 内质网湖参与RCV包膜的形成，从细胞外侵人的RCV均在内吞体／溶酶体内脱去包膜和核衣壳，脱下的包膜和核衣壳被其降解，而RCV在胸腺上皮细胞基质中进行复制。在胸腺细胞内未见有RCV。     

坐骨神经离断后组织型纤溶酶原激活物对脊髓神经细胞的影响

目的：探讨坐骨神经损伤后组织型纤溶酶原激活物(tPA)对脊髓神经细胞的影响及其作用机制。方法：切断SD大鼠一侧坐骨神经，取损伤后0、1、2、4、7和14天的大鼠脊髓L5-L6节段，行石蜡包埋后对其中的tPA、凋亡蛋白(Bax)进行免疫组化检测，用激光共聚焦对tPA在脊髓中的分布及变化规律作进一步分析，RT-PCR技术对L5以下节段伤侧脊髓中tPA和Bax的mRNA水平进行检测。结果：tPA和Bax在蛋白和基因水平变化呈明显的时间、空间相关性。结论：坐骨神经损伤后神经元和神经纤维可释放一定量的tPA，而这些tPA释放的级联放大作用可能是引起神经元死亡的始动原因之一。     

GDF5基因真核表达载体的构建及其在恒河猴骨髓间充质干细胞中的表达

目的克隆人软骨组织生长分化因子5（GDF5）基因及构建GDF5基因真核表达载体，观察其在恒河猴骨髓间充质干细胞（MSCs）中的表达情况。方法采用反转录聚合酶链式反应（RT-PCR）从人胎儿软骨组织克隆hGDF5基因全长cDNA，插入pEGFP-C2载体，构建重组真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5。重组质粒脂质体介导法转染MSCs细胞，荧光显微镜观察报告基因的表达，RT-PCR法检测目的基因表达。结果成功克隆人软骨组织GDF5基因和构建GDF5真核表达质粒pEGFP-C2-GDF5，克隆在载体上的基因长度为1505bp，包含全部cDNA编码序列1505bp，测序显示与Genbank上的序列一致。重组质粒转染恒河猴MSCs细胞得到表达，绿色荧光蛋白在转染24h后开始表达，72h达高峰，然后表达逐渐减弱。转染后72h可检测到GDF5mRNA表达。结论人GDF5基因在恒河猴MSCs细胞的成功表达为应用恒河猴模型开展基于细胞的基因疗法修复骨和软骨损伤研究奠定了必要基础。     

Cloning of Integral Mature Peptide Gene of Human GDF-5

The integral mature peptide gene of human growth differentiation factor-5 (GDF-5) was出人物cloned to provide the essential foundation for study on the biological characteristics of GDF-5 at gene and protein levels. Two primers were chemosynthesized according to the hGDF-5 sequence reported in Genbank. The hGDF-5 gene was gained by RT-PCR methods from the total RNA extracted from human fetus cartilage tissue, and was cloned into vector pMD18-T. The sequence of recombinant plasmid pMD18-T-hGDF-5 was analyzed by sequence analysis. DNA agarose gel electrophoresis showed that the product of RT-PCR was about 380bp, and double enzyme digestion of the recombinant plasmid corresponded with it. The result of sequence assay was in agreement with the reported hGDF-5 sequence in Genbank. Our results showed that the integral mature peptide gene of human GDF-5 was cloned successfully from human fetal cartilage tissue, and totally identified with the seouence of human GDF-5 in Genhank.     

BLU基因慢病毒表达载体的构建

目的:构建BLU基因慢病毒表达载体。方法:采用PCR技术从人脐带来源的间充质干细胞中扩增出BLU基因,将其接入慢病毒载体(pSL6-IRES-EGFP)中,经菌落PCR、酶切和测序鉴定,然后转染293T细胞观察表达情况。结果:PCR、酶切和测序鉴定克隆了重组子(pSL6-BLU-IRES-EGFP),并在293T细胞中成功表达BLU基因。结论:成功地克隆了含有BLU基因的慢病毒表达载体。     

生长分化因子5基因原核表达质粒构建和表达及其体内成软骨的诱导活性

背景：生长分化因子5在软骨、四肢和关节的发育、形成中起着重要作用,是目前最常应用的研究早期关节发育的标志分子。克隆人生长分化因子5基因可为软骨、关节缺损的修复奠定研究基础。 目的：利用基因工程技术在大肠杆菌中表达人生长分化因子5成熟肽,探讨重组蛋白的体内诱导活性。 设计、时间及地点：基因水平观察实验,于2006-01/06在南方医科大学分析测试中心完成。 材料：人流产胚胎膝关节区软骨组织取自解放军广州军区总医院妇产科,标本获取征得家属同意。10只KM小鼠购自南方医科大学实验动物中心,雌雄各半,体质量18~22 g,6~8周龄。 方法：通过反转录聚合酶链式反应(RT-PCR) 从人胚胎软骨组织克隆生长分化因子5完整成熟肽基因,将所得基因片段插入pET22b(+)载体构建重组原核表达载体pET22b(+)-GDF5,重组质粒转化大肠杆菌BL-21进行IPTG诱导表达。凝胶介质镍离子螯合法纯化目的蛋白,植入小鼠后肢股部肌袋内常规苏木精-伊红染色进行生物学活性鉴定。 主要观察指标：琼脂糖凝胶电泳观察目的基因表达条带,测序观察目的基因序列,SDS-PAGE电泳观察目的蛋白表达条带,组织学观察生长分化因子5诱导活性。 结果：RT-PCR产物长约350 bp,阳性克隆质粒经双酶切可切出约350 bp的片段,测序表明与Genbank中的序列完全一致。SDS-PAGE电泳显示重组子转化菌在相对分子质量14 100位置处出现特异外源蛋白表达带,和成熟肽相对分子质量 13 600接近。纯化后体内植入实验组织切片显示,大量的间充质干细胞聚集和增生,并分化成为成软骨细胞,分泌软骨基质并埋入其中变为软骨细胞。 结论：通过RT-PCR法从人胚胎软骨组织中成功克隆出人生长分化因子5完整成熟肽基因,可在大肠杆菌中得到高效表达,经纯化后在动物体内具有成软骨诱导活性。     

大鼠坐骨神经切除后人发角蛋白诱导的神经的再生机制

目的 观察人发角蛋白(HHK)诱导坐骨神经再生时的形态学变化,以揭示神经再生机制,方法制备坐骨神经损伤动物模型,植入HHK丝束桥接体,手术后2天、1、2、3、6、9、12周进行组织学观察.结果 术后第2天到2周,大量新生微血管长入HHK植入部位,切除后近远端的施万细胞发生去分化.去分化后的施万细胞沿着HHK丝束表面纵向分裂增殖.术后第3周人发开始降解,HHK周围可见很多巨噬细胞和多核巨细胞,大量增生的施万细胞有规则地排列于HHK丝间,有轴突和大量的微血管出现.术后第6周,在HHK丝周围可见大量新生的神经纤维,其间有微血管分布.术后第9周,人发角蛋白降解显著,再生神经纤维增多,有明显的神经外膜和束膜.术后第12周,实验组人发角蛋白基本完全降解,其部位被新的神经纤维所取代,并已贯通缺损部位,且外观形态接近正常神经.结论 1,HHK对缺损的坐骨神经修复具有良好的桥接作用.2、受损后高度分化的施万细胞通过去分化形成幼稚的施万细胞,其中胞质脱落起着关键作用.3、受损轴突立即发生保护性封闭、脱落.健康轴突形成膨大的带突起的生长锥,生长锥突起上伸出许多丝状生长芽.并与1到多个施万细胞嵌合,它们通过竞争性选择,最后只有一条生长芽可发育成完整的轴突.4、神经纤维屏障膜(神经外膜、束膜及内膜)是由最外侧的血管屏障膜中和束内的微血管间充质细胞演变而成的.总之,施万细胞、神经轴突、神经膜三者的再生模式是自身器官化过程所要求的,它们是同步进行的协调行为.     

感染冠状病毒的大鼠胸腺组织超微结构观察

目的通过对感染大鼠冠状病毒(ratcoronavirus,RCV)的大鼠胸腺组织进行超微结构的研究,阐明RCV在细胞内形成的形态学机制。方法用在进行自噬性形态学研究中的Wistar大鼠做模型,常规电镜取材、固定、包埋、切片和观察。结果胸腺上皮细胞的胞质内出现大小不等的内质网池,并相互融合形成巨大的内质网湖,湖内充满RCV颗粒,称为病毒包涵体。病毒在内质网囊壁上通过出芽方式进入内质网湖基质,发育为成熟的RCV,最终排出于细胞外。病毒颗粒呈圆形,直径约100~130nm。病毒胞浆成均质状,病毒的膜蛋白有二层,外层为包膜,内层为核衣壳。包膜与核衣壳之间为低电子密度的中间层,其内有时可见1~2层较薄的膜样结构。钉突成放射状贯穿包膜,其内侧端连于核衣壳,外侧端膨大,由一层絮状的糖蛋白包绕,形成日冕状。病毒颗粒分布在胸腺上皮细胞的内质网湖、胞浆、内吞体/溶酶体以及胸腺上皮细胞间,溶酶体内的病毒无包膜和核衣壳。结论内质网湖参与RCV包膜的形成,从细胞外侵入的RCV均在内吞体/溶酶体内脱去包膜和核衣壳,脱下的包膜和核衣壳被其降解,而RCV在胸腺上皮细胞基质中进行复制。在胸腺细胞内未见有RCV。     

大鼠坐骨神经再生过程中的施万细胞自噬作用

目的 探讨大鼠坐骨神经再生过程中的细胞自噬作用。方法 横切大鼠坐骨神经制作wallerian变性模型,分别于造模后0、0.5、1.0、1.5、2.0、3.0、4、5、7、10、15 d取远断端组织行电镜结构观察。结果 轴突在第0.5天时从髓鞘脱离,溃变呈空泡状。第2天开始髓鞘皱褶、断裂形成碎片,神经膜细胞(Schwann cell, 施万细胞)内见大的膜结合髓鞘碎片和许多散在小碎片,并与溶酶体融合形成自噬泡,呈酸性磷酸酶(AcPase)阳性。第4天时内膜区偶见幼稚细胞,1周后见大量幼稚细胞。第7天后施万细胞内自噬泡数量开始减少。实验全程偶见巨噬细胞,内有吞噬泡。结论 大鼠坐骨神经再生过程中溃变髓鞘主要经施万细胞自噬清除,施万细胞脱分化为施万细胞祖细胞后大量增殖分化参与神经再生过程。