血液蛋白质组学的研究进展

蛋白质组学研究已经成为当今生命科学的热点之一。蛋白质作为生命活动的主要承担者,在机体生理功能中发挥着重要作用,一直以来也是研究的重点。蛋白质组学是在特定细胞或组织水平上     

利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因c.392G>T(p.131G>V)突变位点的HEK293T稳定细胞株

目的利用CRISPR/Cas9技术构建敲除G6PD基因常见突变位点——c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T细胞, 为后期研究其基因修复提供可靠的细胞模型。方法针对G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点靶向设计4对向导RNA （sgRNA）,构建表达Cas9-sgRNA的外源PX458质粒,将其转染至HEK293T细胞内,通过流式细胞术分选表达GFP荧光蛋白的 细胞进行培养,利用T7核酸内切酶1（T7E1）酶切验证CRISPR/Cas9的剪切效率,有限稀释法筛选单克隆细胞,测序鉴定并检测 G6PD mRNA、蛋白表达和细胞功能的改变。结果成功构建基于G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的Cas9-sgRNA外 源PX458 质粒,T7E1 酶切检测四对sgRNA 的编辑效率分别为6.74%、12.36%、12.54%、2.94%。测序鉴定敲除G6PD 基因 c.392G>T（p.131G>V）突变位点的细胞株构建成功,细胞G6PDmRNA、蛋白表达和G6PD酶活性降低,细胞增殖能力下降,维生 素K3诱导细胞死亡增加。结论本研究成功构建敲除G6PD基因c.392G>T（p.131G>V）突变位点的HEK293T稳定细胞模型, 为后期研究基因的修复奠定了基础。     

槲皮素对肺腺癌A549细胞生长的影响

目的 观察槲皮素对肺腺癌A549细胞生长及对hTERT基因表达的影响. 方法以台盼蓝拒染法计数肺腺癌细胞的生长抑制率,透射电镜和DNA Ladder实验了解A549细胞凋亡的发生;PCR-TRAP法检测端粒酶活性,实时RT-PCR检测hTERT mRNA表达.结果 台盼蓝拒染法计数显示槲皮素抑制肺腺癌A549细胞增殖的作用明显,且呈剂量和时间依赖性,槲皮素处理48 h后的IC50为22.5 μmol/L.DNA Ladder实验和透射电镜形态学检测显示出细胞凋亡的特征性变化,细胞呈现核固缩、染色质边集、凋亡小体形成等典型凋亡表现.经槲皮素处理后肺腺癌A549细胞hTERT mRNA表达降低,端粒酶活性受抑制. 结论槲皮素能抑制肺腺癌细胞的生长,呈时间、剂量依赖性,能诱导A549细胞凋亡,其抑制增生与诱导凋亡的机制可能与下调hTERT 基因表达,抑制端粒酶活性,破坏端粒稳定性有关.     

应用多色探针熔解曲线法检测G6PD缺乏症杂合子的基因突变

目的 应用多色探针熔解曲线法(multicolor melting curve analysis,MMCA),建立一种快速筛查葡萄糖-6-磷酸脱氢酶(G6PD) 缺乏症杂合子的临床方法.方法 收集重庆地区2015年1月至2016年7月共429例(男性342例,女性87例) 疑似G6PD缺乏症的患者外周血,采用G6PD/6PGD定量比值法和MMCA法分别检测男性和女性G6PD酶活性和基因突变,以金标准Sanger测序来评价两种方法.同时收集重庆地区进行G6PD缺乏症新生儿疾病筛查的1 754份女性末梢血滤纸片,采用MMCA法筛查G6PD基因突变.结果 429例疑似病例中,G6PD/6PGD定量比值法诊断男性的灵敏度96. 8％、特异性100％,与Sanger测序法一致性好(Kappa = 0. 917,P＜0. 05);但女性的灵敏度仅10％,特异性100％,与Sanger测序法一致性差(Kappa = 0. 127,P＜0. 05) .MMCA法诊断男性的灵敏度95. 7％,特异性100％,与Sanger测序法一致性较好(Kappa = 0. 891,P＜0. 05);女性的灵敏度100％,特异性100％,与Sanger测序法结果完全吻合(Kappa = 1. 000,P＜0. 05) .1 754例女性中杂合子占1. 14％(20 /1 754), G6PD酶活性均正常.结论与传统的G6PD/6PGD定量比值法比较,MMCA法检测杂合子灵敏度更高,可用于G6PD缺乏症杂合子筛查,为一种简便、准确的诊断新方法.     

胆固醇酯转运蛋白基因多态性与他汀类药的调脂效应

胆固醇酯转运蛋白作为参与细胞胆固醇代谢过程的一个关键成员,其基因的某些单核苷酸多态如TaqIB,I405V,-629C/A,-631C/A,-971G/A等能影响他汀类药对心血管疾病患者血清胆固醇水平的调节作用.表明胆固醇酯转运蛋白基因单核苷酸多态性可能影响他汀类药的调脂效果及冠心病的疗效.     

siRNA的设计、合成与转染及其在RNA干扰中的应用

基因阻断技术近年来发展迅速，已成为分子生物学研究的主要技术手段之一。1RNA干扰(RNA interference，RNAi)是由双链RNA介导的、在转录后mRNA水平关闭相应基因表达的过程。RNAi最初发现于某些植物中，随后在线虫、果蝇、斑马鱼中相续发现存在RNAi现象。最近，在哺乳动物细胞中的研究也取得满意结果。RNAi作为新兴的基因阻断技术，在人类基因功能研究、基因治疗方面已显示出巨大的前景。     

Experimental study on shRNA targeted hTERT gene to suppress bladder cancer cell growth

Experimental study on shRNA targeted hTERT gene to suppress bladder cancer cell growth@张鹏辉$Faculty Lab Med,Chongqing Univ Med Sci,Chongqing 400016     

冻干鼠疫F1抗体致敏血球的制备及其效价测定

目的 筛选出适合野外鼠疫监测工作需求的冻干鼠疫F1抗体致敏血球.方法 在传统鼠疫F1抗体致敏血球制备方法的基础上增加红细胞保护剂,制备冻干鼠疫F1抗体致敏血球,并通过血凝试验筛选出两种红细胞保护剂蔗糖与海藻糖及两种介质健康兔血清(normal rabbit serum,NRS)、小牛血清白蛋白(bovine serum...     

膀胱移行细胞癌尿脱落细胞和血细胞中hTERT及c-myc的表达

目的 :探讨hTERT和c mycmRNA在膀胱移行细胞癌 (TCC)患者尿脱落细胞和外周血细胞的表达、临床意义及关系 .方法 :采用RT PCR法同时检测膀胱肿瘤细胞株 ,2 8例TCC患者和 15例正常对照尿脱落细胞和外周血的hTERT和c mycmRNA表达 .结果 :尿脱落细胞hTERT和c myc阳性表达率分别为 85 .7%和 71.4 % ,对照组为 13.3%和 2 6 .7% ;血细胞两指标的阳性表达率分别为 78.6 %和 5 7.1% ,对照组为 6 .7%和 33.3% ;肿瘤组与对照组比较具有显著性差异 (P <0 .0 1) ,两指标不同组间比较具有相关性 (P <0 .0 1) .结论 :hTERT和c mycmRNA在TCC中的表达具有相关性 ;二者可作为膀胱癌的良好诊断指标 ,hTERT较c myc特异和灵敏 ;尿脱落细胞较血细胞对TCC的诊断更准确和方便     

荧光定量PCR法和ELISA检测儿童呼吸道感染病原体的意义

儿童呼吸道感染是儿童秋冬季节常见的疾病,临床症状以发热、咳嗽、流涕等为主,近年来除了常见的细菌与病毒感染以外,肺炎支原体(mycoplasma pneumoniae,MP)和肺炎衣原体(chlamydiapliel pneumoniae,CP)也逐渐成为急性呼吸道感染的主要病原体.由于该两类病原体的分离培养方法复杂,所需时间长,不便于临床快速诊断[1],早期检测出病原体而成为临床诊断棘手的问题.目前大多数医院对该两类病原体的检测仍以血清学方法(如ELISA)为主.但近年来随着分子生物学技术的发展,聚合酶链(PCR)反应,尤其是荧光定量PCR技术的广泛使用[2],为病原体的检测提供了新的技术与手段.本研究拟同时采用ELISA和荧光定量PCR技术对儿童呼吸道感染病原体进行检测,比较2种方法对病原体检出的阳性率、一致性和优越性.