重组人ω-干扰素的制备及活性分析

目的：建立人ω-干扰素（hIFN-ω）的大肠杆菌表达系统，为人ω-干扰素的生产及临床应用奠定基础。方法：自抗凝血中提取人基因组DNA，PCR扩增人ω-干扰素成熟肽编码序列克隆入pGEM—T—easy载体，进一步构建表达型重组质粒pBV-IFN-ω，温度诱导表达，表达产物行SDS-PAGE及Western blot鉴定。溶解并复性包涵体，细胞病变抑制法测定表达产物的抗病毒活性。结果：DNA序列分析证实，重组质粒pBV-IFN-ω含有开放读码框架正确的人ω-干扰素成熟肽编码序列。SDSPAGE显示，诱导表达碎菌后的沉淀中有大小约为20kD的外源蛋白，Western blot证明此外源蛋白为重组人ω-干扰素，并经体外活性测定证实有良好的抗病毒活性。结论：成功地构建了人ω-干扰素（IFN-ω）的大肠杆菌表达系统，表达出具有抗病毒活性的重组人ω-干扰素。     

TNF-α与2型糖尿病胰岛素抵抗的关系

目的：探讨血清肿瘤坏死因子-α（TNF-α）水平以及TNF-α基因多态性与2型糖尿病胰岛素抵抗的关系。方法：选取2型糖尿病肥胖患者50例，非肥胖患者50例，健康对照50例，应用酶联免疫法检测血清中TNF-α水平，并应用PCR-RFLP方法检测TNF-α-308启动子区基因多态性，所有数据以SPSS10．0软件进行分析。结果：糖尿病肥胖组血清TNF-α水平较非肥胖组及对照组明显增高．在糖尿病组中TNF-α-308A等位基因携带者体质指数（BMI）及胰岛素抵抗均高于TNF-α-308G等位基因携带者。结论：TNF-α与BMI和胰岛素抵抗明显相关。携带TNF-α-308A等位基因者更易于发生胰岛素抵抗。     

用于PCR实验的毕赤酵母基因组DNA制备方法的比较

目的：比较4种用于PCR实验的毕赤酵母基因组DNA的制备方法，以寻求一种稳定、简便的DNA模板制备方法，用于毕赤酵母重组子的分析。方法：分别用玻璃珠法、煮沸法、煮—冻—煮法以及直接法制备毕赤酵母基因组DNA模板，在相同条件下进行PCR扩增并比较其差异。结果：煮—冻—煮法与玻璃珠法制备的模板进行PCR均可取得理想的实验结果。以煮沸法制备模板作PCR时结果受所用模板浓度的影内很大，稳定性较差。直接法(即直接用未经处理的菌体作模板)的PCR结果随机性较大，实验结果最不理想。结论：煮—冻—煮法所需时间少、费用低、操作简便而且结果稳定，是采用毕赤酵母表达系统进行PCR鉴定时制备模板DNA的首选方法。     

人降钙素在昆虫细胞中的表达

目的：利用昆虫细胞杆状病毒系统表达重组人降钙素(recombinant human Calcitonin，rhCT)，探索一条真核生物表达生物活性rhCT的新途径。方法：将人降钙素基因重组到pFastBac杆状病毒穿梭载体(baculovirus shuttle vector，Bacmid)中，构建重组人降钙素杆状病毒表达载体即rhCT Bacmid，并将其转染昆虫细胞Sf9，表达目的蛋白。并对表达产物进行分子量及免疫反应性鉴定，在初步纯化后对人降钙素表达产物进行大鼠体内低血钙活性检测。结果：证实目的基因在昆虫细胞中获得了表达，表达产物经大鼠体内低血钙活性测定具有生物活性。结论：成功构建了rhCT Bacmid并在昆虫细胞中表达出了具有生物活性的rhCT。     

CS/igf-1基因复合物促骨髓基质细胞增殖及分化的研究

目的:研究壳聚糖/igf-1基因(CS/igf-1)复合物对体外培养的骨髓基质细胞(MSC)分化及增殖的影响。方法:自大鼠股骨及胫骨组织中分离培养大鼠骨髓基质细胞,以含有人igf-1基因cDNA的哺乳动物表达载体pTRacer-igf-1与壳聚糖制备成CS/igf-1复合物加入细胞培养基中进行干预;另设空白细胞组、CS/空质粒干预组及单纯CS干预组作为对照。3H-TdR掺入法、甲苯胺兰染色分别检测细胞的增殖情况及成软骨活性。结果:与空白对照细胞相比,壳聚糖可使所培养的骨髓基质细胞表现出明显的成软骨活性。igf-1基因的参与则可显著促进细胞的增殖。结论:CS/igf-1复合物可促进对体外培养的骨髓基质细胞增殖并向成软骨细胞分化。     

有氧运动对肥胖性高血压大鼠肾素-血管紧张素系统和心功能的改善作用

目的:探讨有氧运动对肥胖性高血压(OH)大鼠肾素-血管紧张素系统(RAS)和心功能的影响,阐明有氧运动对OH的保护作用。 方法:给予健康雄性SD大鼠高脂饮食12周以诱导OH大鼠模型,将30只成功诱导OH大鼠随机分为安静组(OH+S)和有氧运动组(OH+E),同时将接受普通饮食的30只正常大鼠随机分为安静组(N+S)和有氧运动对照组(N+E),每组15只。OH+E组和N+E组大鼠进行8周跑台运动(18 m·min^-1,每次60 min,每周5次)。监测各组大鼠训练8周后的收缩压(SBP)、体质量、血清肾素、血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平,检测血浆甘油三酯(TG)、总胆固醇(TC)、Lee氏指数、脂肪系数(FC)和脂肪含量,同时采用PowerLab数据系统记录各组大鼠左室舒张末期容积(EDV)、左室收缩末期容积(ESV)、短轴缩短率(FS)和射血分数(EF)。结果:OH+E组大鼠训练后的SBP、体质量、血清肾素、血管紧张素Ⅱ和醛固酮水平、血浆TG、TC、Lee氏指数、FC及脂肪含量均低于OH+S组(P<0.05);与OH+S组比较,OH+E组大鼠FS和EF均升高,EDV和ESV均降低(P<0.05);但OH+E组大鼠的上述指标与N+S组和N+E组比较差异仍有统计学意义(P<0.05)。结论:有氧运动可改善OH大鼠的RAS激活并改善心功能,同时改善高血压和肥胖症状。     

人胰岛细胞自身抗原69ku蛋白基因的分离及重组质粒鉴定

目的：应用聚合酶链技术获取作为基因探针和体外表达研究所必需的人胰岛细胞自身抗原６９ku蛋白（hＩＣＡ６９）编码基因,为探讨该基因在不同种系间和（或）组织来源间的差 异打下基础。方法：分别从正常白人胰腺细胞和国人胰岛细胞瘤Ｐoly（Ａ＾＋）－ＲＮＡ中逆转录合成编码人胰岛细胞自身抗原６９ku蛋白（hＩＣＡ６９）的全长cＤＮＡ,以双链cＤＮＡ（ds cＤＮＡ）为模板,经聚合酶链反应（ＰＣＲ）特异性扩增出hＩＣＡ６９基因     

壳聚糖—明胶网络／羟基磷灰石6复合材料支架的研究—制备及形貌

目的 制备壳聚糖－明胶网络／羟基磷灰石（CS－Gel/HA)复合材料多孔支架,并考察组分和制备条件对其微观形貌的影响。方法 采用相分离法制备CS－Gel/HA多孔支架;利用扫描电镜观察微观形貌;液体替代法测孔隙率。结果 采用相分离法,通过控制组分配比和预冷冻温度可制备不同密度和孔隙率的CS－Gel/HA多孔支架。结论 CS－Gel/HA复合材料三维支架有望成为培养自体成骨细胞的支架材料。     

固相酶免疫分析用于血清FT3检测探讨

目的研究血清游离三碘甲状腺原氨酸(FT3)测定的固相酶免疫分析方法.方法用聚苯乙烯固相载体、亲和纯化的兔抗T3抗体和T3-β-半乳糖苷酶标记物建立固相管竞争法、固相板竞争法和固相板顺序饱和法.通过对酶标物进行化学修饰、减少标准品或待测样品的上样量、扩大反应体系和采用顺序饱和法,避免或减少甲状腺激素结合蛋白(TBP)的干扰.结果 3种方法的可测范围均为0.48～45.00 ng/L ,其正常值分别为(4.34±1.03),(4.14±0.97),(4.03±0.82)ng/L .正常人与甲状腺功能亢进症患者能明显分开.3种方法的灵敏度分别为0.150,0.130,0.045 ng/L,平均批内变异系数分别为6.2%,6.4%,5.2%,平均批间变异系数分别为13.1%,12.4%,11.0%.结论固相酶免疫分析法基本解决了TBP的干扰,其测定结果的灵敏度和精密度均达到放射免疫分析法(RIA)的水平.     

三种非病毒载体转染方法的比较

目的：对目前广泛使用的磷酸钙转染法、脂质体转染法以及新兴的壳聚糖转染法这三种非病毒转染载体进行比较。方法：以成肌细胞系C2C12为宿主细胞，含氯霉素乙酰转移酶(CAT)报告基因的质粒pcDNA3．1 CAT为靶DNA，采用3种不同的方法转染细胞，酶联免疫吸附测定(ELISA)细胞裂解液中CAT的相对含量。结果：脂质体法转染的细胞裂解液中CAT含量最高，磷酸钙法所转染的细胞裂解液中CAT含量最低。结论：经商品化的转染试剂lipofectamine 2000在此三种转染试剂中具有最高的转染效率。作为一种天然材料，壳聚糖亦有较高的转染效率。