三维立体培养SD大鼠骨髓间充质干细胞的研究

目的 建立三维立体培养SD大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)的方法.方法 分离SD大鼠胫骨、股骨,冲洗骨髓腔,通过密度梯度离心并结合贴壁法培养BMSCs,流式细胞仪检测其生长周期,电子显微镜观察其内部结构,免疫细胞化学法进行细胞表面抗原标志物鉴定.后将其接种到细胞外基质(extracellular matrix,ECM)胶中,加入DMEM-F12细胞培养液进行三维立体培养.结果 培养的细胞呈梭形,成纤维细胞样,单核,增殖能力强.流式细胞术显示93.10%细胞处于G0～G1期.透射电镜结果显示细胞核质比例较大,核仁大而明显,细胞表面有较多微绒毛,细胞质细胞器丰富,表现出未分化细胞的特征.免疫组织化学结果显示细胞表达波形蛋白(vimentin)、纤维连接蛋白(fibronectin),不表达角蛋白(keratin).BMSCs在ECM胶中生长良好.结论 分离、培养的细胞为骨髓BMSCs,在三维培养体系中生长良好.     

胱抑素C与细胞外基质

半胱氨酸蛋白酶是一类重要的细胞外基质降解酶。半胱氨酸蛋白酶抑制剂C ,简称胱抑素C(CC)是这一蛋白酶抑制剂超家族主要成员之一。近来研究发现 ,CC通过对半胱氨酸蛋白酶活性的调节及其它可能的途径 ,参与了多种组织ECM代谢 ,与组织纤维化的发生、发展可能有密切关系。     

泛素-蛋白酶体途径与肾脏疾病

泛素-蛋白酶体途径（ubiquitin-proteasome pathway,UPP）是一种广泛存在于真核细胞胞浆中非常重要的、依赖ATP的非溶酶体蛋白降解通路,能高效并高度选择性地进行细胞内蛋白质转换.它涉及细胞周期的调控、细胞凋亡、抗原提呈、炎症演进和基因转录及表达[1]等多方面,尤其是通过降解细胞内各信号通路的抑制因子或/和激活因子发挥着上调或下调作用.其成分的改变或功能异常将引起蛋白质的降解障碍,导致细胞功能紊乱.UPP的异常可能与诸多疾病有关[2],现已证明,许多肾脏疾病的病理生理过程和UPP密切相关.     

肾间质纤维化模型建立中大鼠行为改变的研究

本试验以建立单侧输尿管梗阻肾间质纤维化大鼠动物模型为基础,观察实验性肾间质损害过程中大鼠行为的改变情况,分析其与肾间质纤维化、肾脏功能之间的相关性,探讨其中生物行为学的改变及其意义。材料与方法一、动物模型的建立和分组Wistar大鼠(由第三军医大学实验动物中心提供)     

肥大细胞类胰蛋白酶对人肾成纤维细胞作用机制探讨

肥大细胞在身体广泛分布，近年发现在肾组织的炎症和纤维化部位常有大量肥大细胞浸润，且与其病变程度呈正相关，是预后的标志之一。肥大细胞激活后分泌大量炎性介质，其中最丰富的介质是一种四聚体的丝氨酸蛋白水解酶(类胰蛋白酶)，占肥大细胞蛋白重量的25％左右。这种酶可能是通过蛋白水解酶激活受体2(PAR-2)发挥其效应的。     

慢性肾衰竭大鼠主动脉NF-κB的表达变化

目的探讨尿毒症时主动脉局部炎症信号NF-κB表达变化。方法采用单肾切除、对侧肾动脉部分结扎法建立慢性肾衰竭模型，RT-PCR检测NF-κB p65亚基、I-κB mRNA表达水平，免疫组织化学检测p65亚基蛋白表达，凝胶迁移率法测定NF-κB活性，并用图像分析定量。结果与正常大鼠比较，慢性肾衰竭大鼠主动脉NF-κB p65亚基mRNA表达水平显著升高（P〈0．01），而I-κB mRNA表达水平显著降低（P〈0．01），NF-κB p65亚基蛋白表达和活性也显著增加（P〈0．01），并随病程延长而进一步上升。蛋白酶体抑制剂MG-132可明显抑制慢性肾衰竭大鼠主动脉NF-κB组分表达和活性升高。结论慢性肾衰竭大鼠主动脉NF-κB炎症信号通路存在显著活化。     

TGF-β1对人肾成纤维细胞热休克蛋白47表达的影响

目的 探讨TGF-β1在肾组织纤维化中的作用机制.方法 采用原代培养的人肾成纤维细胞,将细胞分为0、0.1、1、5ng/ml和10ng/ml不同浓度TGF-β1刺激培养组.应用免疫细胞化学方法检测TGF-β1作用下人肾成纤维细胞热休克蛋白47(heat shock protein 47,HSP47)表达,RT-PCR方法检测TGF-β1作用下人肾成纤维细胞HSP47和I型胶原mRNA表达.结果 (1)对照组(0ng/ml TGF-β1组)人肾成纤维细胞几乎无HSP47表达,在 TGF-β1刺激下,培养的人肾成纤维细胞HSP47表达增强.(2)在0.1～5ng/ml范围内,TGF-β1以剂量依赖方式促进培养的人肾间质成纤维细胞表达HSP47和I型胶原mRNA.结论 TGF-β1促进肾组织纤维化形成,可能部分是通过其促进肾间质成纤维细胞表达HSP47,进而增加胶原合成所致.     

BMP-7对高糖诱导近端肾小管上皮细胞外基质及NF-κB表达的影响

目的探讨骨形态发生蛋白7（BMP-7）对高糖诱导近端肾小管上皮细胞（HKc）表达细胞外基质及核转录因子-κB（NF-κB）的干预作用。方法采用人近端肾小管HKc细胞株,将细胞分为正常对照组（NG,5．5mmol／L葡萄糖）、高糖组（HG,25mmol／L葡萄糖）、HG＋100ng／ml BMP-7组、NG＋100ng／ml BMP-7组、高渗组（HM,25mmol／L甘露醇）。应用免疫细胞化学和ELISA技术检测细胞Ⅳ型胶原（Col Ⅳ）、纤维连接蛋白（FN）表达,用凝胶电泳迁移率竞争试验（EMSA）检测NF-κB的表达。结果高糖作用下NF-κB活性和Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白表达显著增高,加入100ng／ml BMP-7后可显著抑制NF-κB活性及Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结论BMP-7可能通过抑制NF-κB活性而从转录水平抑制高糖诱导的近端小管细胞细胞外基质的过度表达。     

BMP-7对高糖诱导近端肾小管上皮细胞外基质及NF-κΒ表达的影响

目的探讨骨形态发生蛋白7(BMP-7)对高糖诱导近端肾小管上皮细胞(HKc)表达细胞外基质及核转录因子-κΒ(NF-κΒ)的干预作用。方法采用人近端肾小管HKc细胞株,将细胞分为正常对照组(NG,5·5mmol/L葡萄糖)、高糖组(HG,25mmol/L葡萄糖)、HG 100ng/mlBMP-7组、NG 100ng/mlBMP-7组、高渗组(HM,25mmol/L甘露醇)。应用免疫细胞化学和ELISA技术检测细胞Ⅳ型胶原(ColⅣ)、纤维连接蛋白(FN)表达,用凝胶电泳迁移率竞争试验(EMSA)检测NF-κΒ的表达。结果高糖作用下NF-κΒ活性和Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白表达显著增高,加入100ng/mlBMP-7后可显著抑制NF-κΒ活性及Ⅳ型胶原、纤维连接蛋白的表达。结论BMP-7可能通过抑制NF-κΒ活性而从转录水平抑制高糖诱导的近端小管细胞细胞外基质的过度表达。     

肥大细胞类胰蛋白酶对人肾成纤维细胞MCP-1和PAR-2表达的影响

目的进一步探讨肥大细胞类胰蛋白酶在慢性肾组织纤维化中的作用。方法采用胶原酶消化法从肾肿瘤患者切除的肾标本获取肾组织(经光镜检查,无肿瘤细胞浸润)分离、培养人肾间质成纤维细胞。应用细胞形态学、免疫细胞化学鉴定培养的细胞为人肾成纤维细胞后,分组进行下一步实验。应用RT-PCR检测单核细胞趋化因子1(MEP1)和蛋白水解酶激活受体2(PAR-2)mRNA的表达。结果成功培养了人肾成纤维细胞,肥大细胞类胰蛋白酶(10～500ng／ml)可促进肾间质成纤维细胞：PAR-2和MCP-1mRNA的表达,且依赖于肝素的存在。蛋白水解酶抑制剂苯甲脒(200μmol／L)能抑制类胰蛋白酶的上述效应。TGF-β中和抗体不影响上述效应。结论肥大细胞类胰蛋白酶可能通过PAR-2直接作用于肾问质成纤维细胞,促进人肾成纤维细胞表达MCP-1,参与肾间质纤维化过程。