人骨唾液酸蛋白酵母工程细胞的构建与表达

目的构建表达重组人骨唾液酸蛋白 (rhBSP)的巴斯德毕赤酵母工程细胞 ,实现rhBSP的酵母胞外分泌性高表达。方法通过PCR扩增获得人BSP基因后 ,构建重组表达载体pPICZaA hbsp ,经电转化导入到毕赤酵母GS115菌中 ,获得GS115 pPICZaA hbsp工程菌 ,通过Zeocin高抗性筛选和摇瓶发酵筛选出高表达rhBSP的菌株 ,并进行高密度发酵提高表达量。结果rhBSP分子量接近 6 6 0 0 0 ,产物可达上清液总蛋白的 80 % ,浓度约 0 .2 4 8g L。结论基因工程菌GS115 pPICZaA hbsp能高效地表达rhBSP并分泌到胞外     

在2.2.15细胞中siRNA对HBV复制和表达的抑制

目的：检测设计的siRNA对HBV复制和表达的影响。方法：选择针对乙型肝炎病毒（HBV）的siRNA基因序列，化学修饰合成3种stealth siRNA，脂质体转染带有HBV的2．2．15细胞，EMSA法及荧光定量PCR检测其对HBV复制和表达的影响。结果：3种stealth siRNA对HBV的复制和表达在不同时间有不同程度的抑制作用。结论：HBV在2．2．15细胞中的复制和表达被stealth siRNA抑制。     

抗人血管生长素噬菌体基因工程抗体库的构建

目的 构建抗人血管生长素基因工程抗体文库。方法 采用ＰＣＲ等分子生物学手段从小鼠杂交瘤细胞中获取抗人血管生长素抗体变可区重、轻链基因，通过噬菌体表面呈现技术表达抗体。结果 １获取了抗人血管生长素抗体可变区基因片段（ＳｃＦｖ），２得到了抗人血管生长素基因工程抗体文库。结论 本研究建立了一种构建高效抗人血管生长素抗文库的方法，该抗体库在肿瘤的临床治疗上具有广阔的应用前景。     

大鼠IL-12基因双亚基真核表达质粒的构建及表达

目的 构建双亚基共表达的大鼠白细胞介素12（rIL—12）基因真核表达载体质粒。方法 用Trizol提取大鼠腹腔巨噬细胞总RNA．RT—PCR方法分别获取rp40和rp35两个亚基的cDNA．依次克隆入pcDNA3．1（-）／myc—His A质粒中．以脊髓灰质炎病毒的内核糖体进入位点连接双亚基，构建成双顺反子真核表达载体质粒pcDNA3．1／rIL-12。用电转染法将构建的重组质粒转染大鼠胶质瘤9L细胞．G418筛选单克隆细胞株．ELISA法检测其培养上清rIL—12（p70）蛋白含量．同时抽提细胞RNA．RT—PCR方法检测rp40、rp35基因在9L/IL-12细胞中的表达。结果 所得rp40cDNA序列与GenBank NM022611和AF133197、rp35cDNA序列与GenBank NM053390和AF177031均一致，构建的质粒经PCR、酶切及测序鉴定正确。质粒转染9L细胞，获得9L／rIL-12单克隆细胞株，其培养上清rIL—12（p70）蛋白含量达139．0～162．1PG／mL．RT—PCR结果显示细胞中rIL—12基因表达阳性。结论 成功构建并鉴定了大鼠IL—12真核表达质粒pcDNA3．1／rIL—12。     

抗人血管生长素单链抗体可变区基因的定向克隆及序列分析

血管生长素（ａｎｇｉｏｇｅｎｉｎ，ＡＮＧ）是一种存在于正常人血浆及实体肿瘤组织中的蛋白质，它具有很强的促血管生长作用。大量研究表明：ＡＮＧ与肿瘤的快速生长和转移有密切的关系＾〔１〕。ＡＮＧ单抗可以通过中和ＡＮＧ或阻断ＡＮＧ与血管内皮细胞受体的结合而实现其抑瘤作用＾〔１〕，但传统的杂交瘤技术制约了ＡＮＧ单抗的制备，而基因工程抗体技术具有克隆筛选简捷、抗体制备方便及易进行抗体基因修饰操作等优点。本文通过抗人ＡＮＧ单链抗体可变区基因的定向克隆和序列分析的研究，将为临床提供一种经济有效的新型抗体打下基础。     

Canstatin RNA转染对兔血管平滑肌细胞体外增殖的抑制作用

目的:探讨canstatin对体外培养的兔血管平滑肌细胞(VSMC)增殖的影响。方法:将阳离子脂质体介导的canstatinRNA转染VSMC,应用细胞计数,[³H]-TdR掺入率测定观察canstatin基因对VSMC增殖的作用。结果:阳离子脂质体介导的canstatinRNA可有效地转染VSMC并能显著地抑制VSMC的增殖及其DNA的合成率。结论:Canstatin基因可抑制体外培养的VSMC的增殖.     

新型抗钙化牛颈静脉管道材料的体外细胞毒性评价

背景：Triton X-100、环氧氯丙烷联合改性处理戊二醛固定的牛颈静脉管道是一种新型抗钙化右心管道材料,其生物相容性方面的研究较少。 目的：评价新型抗钙化牛颈静脉管道的体外细胞毒性。 方法：通过CCK-8法检测新型抗钙化牛颈静脉管道(实验组)及单纯戊二醛处理牛颈静脉管道材料浸提液(对照组)对L-929小鼠成纤维细胞的毒性作用,以第2,4天为检测时间点,计算细胞相对增殖率、对材料毒性进行分级。 结果与结论：CCK-8法细胞毒性试验显示新型抗钙化牛颈静脉管道材料浸提液第2,4天L-929细胞增殖率均在85%以上,毒性分级为1级,无细胞毒性,且显著优于对照组(P < 0.05)。提示经戊二醛、Triton X-100、环氧氯丙烷联合处理制备的新型抗钙化牛颈静脉管道材料无细胞毒性。     

血清胱抑素C在慢性肝病发展过程中的变化及临床意义——附280例检测分析

目的：探讨血清胱抑素c在慢性肝病发展过程中的变化及其临床意义。方法：280例肝病患者根据临床诊断指标分为肝硬化代偿组、肝硬化失代偿组、肝肾综合征组及肝癌组,各70例,同时取同期70名健康人作为对照组。采用胶乳增强免疫透射比浊法测定肝病组及对照组的血清胱抑素C水平,同时用酶法测定血清肌酐水平。比较各组两指标的差异。结果：不同时期肝病患者的血清胱抑素C水平均明显高于对照组（均为P〈0．01）;血清胱抑素C水平随肝硬化程度的加重而升高,而肝癌组仅高于肝硬化代偿组。在各肝病组中,仅肝肾综合征组的血清肌酐水平高于对照组（P〈0．01）,而其他肝病组的血清肌酐水平与对照组接近（P〉0．05）。肝硬化失代偿期组、肝癌组、肝肾综合征组的血清胱抑素C异常率明显高于血清肌酐异常率（P〈0．05-0．01）。结论：随着肝病病程的进展,血清胱抑素C水平逐渐升高,反映出其肾损害越发明显,监测该指标对了解慢性肝病患者的早期肾损伤具有积极的意义。     

人ING4的基因克隆及真核表达

目的 克隆人生长抑制因子家族(inhibitor of growth famility member4,ING4)基因,构建其真核表达载体pEGFP-ING4.方法 提取人胎盘总RNA,经RT-PCR扩增出ING4 cDNA,克隆至pEGFP-C2载体,构建的真核表达载体pEGFP-ING4用双酶切、基因测序进行序列鉴定;转染MCF-7细胞用荧光显微镜和免疫组化检测重组质粒的表达.结果 RT-PCR产物为750 bp的条带,双酶切和基因测序正确,转染可见目的 蛋白融合表达.结论 从人胎盘组织中成功克隆了ING4基因并构建其真核表达质粒在人MCF-7细胞中表达,为进一步研究ING4基因的作用及抗肿瘤机制奠定了基础.     

EMA-PCR方法检测饮用水中3种食源性致病菌活菌研究

摘要:目的　将EMA（Ethidium Monoazide Bromide）选择渗透性与PCR技术相结合,建立有效快速检测饮用水中3种食源性致病菌活菌EMA-PCR方法。方法　以鼠伤寒沙门菌invA、肠出血性大肠杆菌O157:H7 rfbE、铜绿假单胞菌oprI基因为PCR检测靶基因,纯培养物提取模板进行PCR,进行EMA使用浓度及灵敏度试验。结果　EMA浓度不大于10 μg/ml对活菌DNA扩增没有明显抑制,终浓度为1 μg/ml EMA能有效抑制死菌扩增;对鼠伤寒沙门菌、肠出血性大肠杆菌O157:H7、铜绿假单胞菌的EMA-PCR灵敏度分别为1.2×104 CFU/ml、2×105 CFU/ml、3×104 CFU/ml;用10 μg/ml EMA处理饮用水水样,可同时检测出饮用水中含有的3种食源性致病菌活菌。结论　EMA-PCR方法可一次检测饮用水中3种食源性致病菌活菌,能避免PCR检测可能造成假阳性结果。