增生性瘢痕血管形成抑制作用中色素上皮衍生因子的分子克隆与真核表达

目的：克隆人色素上皮衍生因子(Pigment Epitheium-Derived Factor，PEDF)全长cDNA，建立稳定表达人PEDF分子的哺乳动物细胞系。方法：RT-PCR获取人PEDF cDNA，序列测定后克隆人真核表达载体pCDNA3．0中，用脂质体转染入HepG2细胞，G418筛选出稳定表达细胞系，用RT-PCR与Westem blot分别检测RNA和蛋白表达水平。结果：RT-PCR扩增得到预期大小的目的条带，序列分析表明成熟肽编码区与发表序列完全一致；克隆人pCDNA3．0中得到PEDF真核表达载体，G418筛选3周后得到稳定表达细胞系，RT-PCR与Westem blot显示PEDF在HepG2细胞中有高水平表达。结论：人PEDF全长cDNA成功克隆，并在哺乳动物细胞系HepG2中获得稳定表达，为进一步研究PEDF分子对增生性瘢痕血管形成的作用奠定了理论基础。     

血管生成抑制因子METH-1腺病毒载体的构建

目的:利用大肠杆菌同源重组构建重组腺病毒载体并在293细胞制备高滴度的病毒。方法:实验于2004-08/2005-08在中山大学眼科中心国家重点实验室完成。自真核表达载体pMD18-T-METH1中酶切出METH1基因,亚克隆至带有增强型绿色荧光蛋白表达盒的腺病毒穿梭质粒pAdTrack-CMV中,形成转移质粒pAdTrack-CMV-METH1,在大肠杆菌BJ5183内与腺病毒骨架质粒pAdEasy-1同源重组,得到重组腺病毒载体pAd-METH1。以pAd-METH1为模板,经DNA测序正确后,用PacI酶切线性化pAd-METH1,转染293细胞,包装成重组病毒颗粒,荧光显微镜观察转染细胞增强型绿色荧光蛋白的表达,采用聚合酶链反应方法对重组腺病毒进行鉴定。结果:①构建了携带外源基因人血管生成抑制因子的穿梭载体pAdTrack-CMV-METH1。②制备了METH1重组腺病毒载体pAdEasy-METH1。③METH1重组腺病毒可感染293细胞并在293细胞中进行有效的复制。结论:应用细菌内同源重组能够快速构建腺病毒载体,制备高滴度重组病毒,为METH1基因功能研究奠定了基础。     

音猬因子诱导恒河猴骨髓间质干细胞向神经元样细胞的分化:与维甲酸方案比较其信号分子表达变化的意义

背景：近来研究发现在神经发育过程中,神经干细胞的分化受到来自周围微环境中诸多调控因子的作用,其中音猬因子是神经胚胎发育过程中关键性的诱导信号,有望作为一种有效的诱导剂调节神经细胞的分化。 目的：探讨音猬因子诱导恒河猴骨髓间质干细胞向神经元样细胞分化过程中的信号分子表达变化。 方法：常规密度梯度离心法分离培养恒河猴骨髓间质干细胞,诱导组加入含FGF2、B27、胎牛血清的L-DMEM预诱导24 h撤离血清后,分别加入含0.5 μmol/L维甲酸或400 μmol/L音猬因子的DMEM诱导8 d,以未诱导的细胞作为对照组。经神经元烯醇化酶荧光标记后,流式细胞仪筛选阳性细胞,应用RT-PCR与Western-blot法检测音猬因子和维甲酸诱导的细胞膜受体、细胞内信号蛋白的变化。 结果与结论：音猬因子特异性膜受体Ptc、维甲酸特异性受体RARα、信号蛋白分子ptch1及Smad在正常细胞均有表达。经音猬因子诱导的细胞其Ptc表达上调,且随着诱导时间延长持续高表达,明显强于维甲酸诱导组及对照组(P < 0.01);其细胞内ptch1蛋白分子表达与此趋势一致,但不能引起RARα表达上调。经维甲酸刺激的细胞在诱导过程中没有激活Ptc通路,诱导4 d后RARα表达出现小幅上调并持续至6 d,但这一结果差异不具有显著性意义,ptch1的表达无明显变化。经音猬因子、维甲酸诱导的细胞Smad分子表达均上调,但无明显差异。证实音猬因子诱导方案通过持续激活其特异性受体途径参与细胞诱导分化过程,而维甲酸诱导方案和音猬因子诱导方案之间没有显著受体途径交叉。     

格瑞林对慢性心力衰竭大鼠心肌组织中细胞凋亡信号调节激酶1表达的影响

目的：探讨格瑞林对CHF大鼠心肌组织中ASK1表达的影响。方法：采用结扎左冠状动脉前降支建立大鼠CHF模型,通过HE染色观察大鼠心肌细胞形态变化,免疫组织化学观测ASK1在大鼠心肌组织中表达的变化。结果：CHF模型治疗组心肌损伤较CHF模型组明显减轻,差于假手术对照组;CHF模型治疗组ASK1阳性表达区面积与总面积之比低于CHF模型组（P〈0.05）,高于假手术对照组（P〈0.01）。结论：格瑞林可抑制心肌组织中ASK1的表达,改善心功能,抑制心肌重塑,延缓CHF的进程。     

细胞因子在生发中心细胞的表达

生发中心含有大量增殖B细胞(CD77~+),少量T细胞(CD57~+/CD4~+)和滤泡树突状细胞(FDc,HJZ+)。其中CD57+TH细胞几乎仅存在于生发中心。为了研究细胞因子对生发中心微环境中的B细胞发育所起的作用,搞清生发中心中细胞因子的来源,对10种和B细胞增殖、分化密切相关的细胞因子(IL一la,IL一ip,iL一2,IL一3,IL一4,IL一5,IL一6,IL一10,TNF一a和IFN一Y)的mRNA在上述生发中心细胞中的表达进行了检     

Hoechst33342、BrdU和GFP示踪恒河猴皮肤干细胞的实验研究

目的： 通过采用Hoechst33342、5-溴-2-脱氧尿嘧啶（BrdU）和绿色荧光蛋白（GFP）3种不同的方法标记恒河猴皮肤干细胞，探索最有效、便利的干细胞示踪方法。方法： 体外培养纯化恒河猴皮肤干细胞后，分别用Hoechst33342、BrdU以及GFP基因转染3种方法标记皮肤干细胞。Hoechst33342和GFP标记皮肤干细胞直接通过荧光显微镜进行鉴定，BrdU标记后的细胞通过细胞免疫化学鉴定，均用流式细胞仪检测标记率。对绿色荧光蛋白标记的干细胞利用显微注射仪挑选阳性细胞进行纯化。结果： 3种标记方法对细胞均未显示明显毒性。其中，Hoechst33342的标记率最高（100％），但随时间延长荧光有衰减；BrdU标记细胞较稳定，实验期间细胞内BrdU无明显减少，标记率较高（75.81％）；GFP标记最稳定，但标记率低（7.5％），显微注射仪挑选阳性细胞，阳性率高，无明显细胞损伤。结论： GFP基因转染皮肤干细胞，是一种明确、有效的标记细胞的方法，对成体干细胞的示踪有重要意义，用显微注射仪挑选细胞阳性率高，细胞损伤小，利于进一步实验。     

锁骨钩钢板治疗肩锁关节脱位的疗效分析

在临床工作中对于骨科医生来讲肩锁关节的脱位是一种常见的肩关节部位的创伤,据不完全统计,绝大多是致伤原因多是由直接暴力或间接暴力引起,受伤同时并且经常伴有肩关节其他部位的损伤,如:肩关节脱位合并大节结撕脱骨折、肱骨近端颈骨折、锁骨骨折、肩部软组织挫伤等等。根     

视网膜神经节细胞谷氨酸毒性的防护研究

目前认为谷氨酸兴奋毒性是触发青光眼和／或视网膜缺血性神经节细胞损伤级联反应的最主要因素。大量研究表明，预防性阻断谷氨酸兴奋毒性可以保护视网膜神经节细胞，减少缺血损伤和神经节细胞凋亡。现就近年来抗谷氨酸毒性，保护视网膜神经节细胞的方法和药物作一简要综述。     

接受供精辅助生殖技术治疗夫妇知情同意与生育伦理知识调查研究

目的：探讨接受供精辅助生殖技术（ART）治疗夫妇对知情同意和生育伦理的认知、行为和态度。方法：对在广东省计划生育专科医院登记接受供精人工授精技术治疗的92例对象进行自填式问卷调查。内容包括一般信息、生育压力、知情同意和生育伦理的认知、态度和行为。资料处理方法采用描述性统计。结果：对象面临强烈的生育渴求和巨大的生育压力,且主要来源于对象自己、社会和父母。对供精人工授精技术治疗有比较充分的知情,但仅有75%的对象知道ART后代可能发生出生缺陷。在接受供精人工授精技术治疗时,如果可以选择供精者生物学特征时,58%的对象优先选择供精者身高,其次是相貌和学历。对象支持在治疗前签署知情同意书。结论：对接受供精ART治疗的夫妇,在治疗前应做好知情同意的全过程。     

实验性急性高眼压对兔视网膜电图的影响

目的：检测家兔实验性急性高眼压不同压力状态下视网膜电图的变化。方法：采用视电生理检测仪测定家兔实验前,30mmHg(1mmHg=0.133kPa),60mmHg,90mmHg和120mmHg前房高压灌注45min及恢复正常眼压4h的视网膜电图（Flash Electroretinogram FERG)和振荡电位（Oscillatory Potentials,OPs)。结果：对照组和30mmHg组视电生理检测在实验前后无差异。60mmHg组在高压持续45min后,b波和OPs波振幅下降,4h后恢复正常。90mmHg和120mmHg组在高压45min后,FERG波形消失。4h后有不同程度恢复。结论：随着实验性高眼压压力的升高,家兔视网膜功能损伤加重,恢复能力减弱。