关节软骨源性微载体与软骨细胞的体外相容性

目的评估人关节软骨源性微载体与人软骨细胞的体外粘附性。方法切取人关节软骨,对之冷冻干燥后,经粉碎机粉碎,筛取150～200μm大小的软骨粒,经0.25%的胰酶在37℃消化24h,再经1%的化学去污剂TritonX-100震荡72h,蒸馏水清洗48h后,在冻干机内再次冻干12h,经钴60灭菌后,与第6代人软骨细胞共同培养,分别在倒置显微镜下和电镜下观察即刻、2h、8h、30h的粘附情况。结果倒置显微镜下见软骨粒变为绒球状或毛刷状,将此微载体加入培养基后,即见有呈圆球形的软骨细胞与微载体相粘附,2h见微载体上粘附了大量软骨细胞,仍呈圆球形,8h见微载体上粘附的大量软骨细胞仍呈圆球形,而瓶底贴附的软骨细胞已呈现为成纤维细胞样形状,30h见软骨细胞-微载体复合体已沉降贴附于培养瓶底部,软骨细胞增殖明显并向周围伸展,而电镜下观察见粘附于微载体上的软骨细胞仍维持了软骨细胞的形状。整个观察期间均见软骨细胞增殖良好,提示制备的关节软骨源性微载体对软骨细胞无毒害作用。结论关节软骨源性微载体与软骨细胞的体外相容性良好。     

人关节软骨脱细胞基质制备实验

背景:对天然的细胞外基质进行处理,剔除其抗原成分,保留了组织结构的完整性,这种材料具有良好的生物相容性,能为细胞创造尽可能接近体内的培养环境,因此应是组织工程中细胞培养支架的首选.目的:制备人关节软骨脱细胞基质,为进一步研究关节软骨基质作为细胞外支架材料提供方法学资料.设计:以骨组织标本为实验对象,单一样本研究.单位:解放军总医院骨科研究所.材料:实验于2004-01/05在解放军总医院骨科研究所完成.材料来自因股骨颈头下型骨折行关节置换而切除的股骨头.方法:切取人关节软骨,剪裁成3.5 mm&;#215;4.5 mm&;#215;2.0mm大小共10块,冻干处理12h,采取化学去污剂Triton X-100及DNA酶和RNA酶等试剂制备脱细胞的人关节软骨.用苏木精-伊红、番红O及软骨蛋白聚糖免疫组化染色等方法进行关节软骨脱细胞定性检测.主要观察指标:脱细胞关节软骨的组织学观察以及软骨蛋白聚糖免疫组织化学染色结果.结果:①苏木精-伊红染色、番红O染色均显示细胞陷窝内已无细胞结构.②软骨蛋白聚糖免疫组织化学染色阳性,提示脱细胞关节软骨基质内仍存在软骨蛋白聚糖.结论:人关节软骨冻干后,经去污剂-酶等处理方法可脱去软骨的细胞成分,成功制备人关节软骨脱细胞基质.其中保留的软骨蛋白聚糖可能仍存在原有的耐压特性.     

采用藻酸钙培养法在体外构建工程化关节软骨组织

Masuda等最近报道了用藻酸钙短期培养牛软骨细胞。然后利用收集的细胞及基质培养成无支架的软骨组织获得成功。我们试图用羊的软骨细胞，采用该方法培养无支架的软骨组织，为构建组织工程软骨用于临床开辟新的途径。     

生物活性材料成骨活性的体外测定

目的:运用动物体内实验的方法测定生物活性材料成骨活性有较多缺点,为快速有效地评价成骨活性的生物材料,探索一种新的体外测定成骨活性的方法.方法:实验于2004-01/2005-05在解放军总医院骨科研究所完成.取羊脱钙骨基质和复合材料(粗制羊骨蛋白 羊脱钙骨基质 牛腱Ⅰ型胶原)两种活性材料分别做免疫组织化学染色检查是否含有骨形成蛋白(bone morphogenetic protein,BMP).并取脱钙骨基质、复合材料、rhBMP-2、3种材料与小鼠C2C12细胞共培养72 h后,用1% Triton将细胞裂解,取细胞裂解液测定碱性磷酸酶和总蛋白.利用所测定的碱性磷酸酶和总蛋白吸光度比值代表单位数量的细胞中所含碱性磷酸酶的含量.同时设立阴性对照(单纯细胞不加任何材料).结果:脱钙骨基质和复合材料中均含有BMP-2.用3种材料刺激C2C12细胞后,测定C2C12细胞中碱性磷酸酶含量高于阴性对照(P＜0.05).rhBMP-2刺激C2C12细胞产生的碱性磷酸酶含量较其他材料明显增高(P＜0.001).结论:体外测定生物材料成骨活性在实际应用中具有操作简便、效果可靠的特点.     

正常人与慢性牙周炎伴有骨质疏松患者牙槽骨组织体外培养细胞系的生物学特性

背景:培养人牙槽骨细胞系,因细胞来源于牙槽骨,取材于口腔很容易污染,常导致实验室研究失败,又因为标本来自成年人,细胞分裂指数低,培养的成功率低。目的:比较无菌手术中取正常人和慢性牙周炎伴骨质疏松患者的牙槽骨组织,经体外培养,建立的传代、冻存、复苏成活的细胞系的生物学特性。比较两种细胞的生物学特性。为牙槽骨的缺损、修复、治疗提供理论和相关实验依据。设计:对照观察。单位:首都医科大学附属北京朝阳医院口腔科和解放军总医院骨科研究所。材料:无菌手术中取正常人和临床诊断为慢性牙周炎患者的牙槽骨组织。方法:由正常人和慢性牙周炎伴骨质疏松患者的牙槽骨组织经体外培养,从原代培养出来的4个细胞系(H-171、H-258、261、262)中,选出牙周炎患者组细胞系H-171,正常组H-258,用组化、免疫组化等染色,观察细胞形态。用细胞计数法计算出两种细胞倍增时间和分裂指数。经过多次传代、冻存、复苏,比较细胞的生长、老化规律。主要观察指标:两组细胞系的传代情况及生物学特性。结果:①异常牙槽骨组,原代培养一次成功,细胞形态为短梭形,3次冻存,3次复苏均存活,其倍增时间为53.4h。平均分裂指数为4‰。细胞传代20次后,仍生长良好。②正常牙槽骨组原代培养26例,因多种原因能传代的细胞系仅有3例,已传代10次,形态为长梭形,经两次冻存复苏,细胞存活、生长速度较H-171慢,倍增时间为65.9h,平均分裂指数3.5‰。③两种细胞均贴壁生长,具有成骨细胞的特点:AKP、甲苯胺兰、PAS、四环素标记矿化结节组化染色及Ⅰ型胶原、BMP-2免疫组化染色均为阳性。结论:培养出的两种细胞均具有成骨细胞特点,其中H-171生长速度较H-258快,传代20次,无明显变异,H-258传到8代开始老化,生长速度减慢。     

脂肪干细胞向软骨细胞方向诱导的初步研究

目的 :研究脂肪干细胞的分离及向软骨方向定向诱导的方法。方法 :从成年兔颈后部或腹股沟处脂肪组织取材 ,酶消化法分离、培养脂肪干细胞 ;免疫荧光测定CD3 4 抗原的表达 ;流式细胞仪测定CD3 4 抗原百分比 ;分别用15 %牛血清、少血清 (5 % )及无血清诱导培养基定向软骨细胞方向诱导 ;组化及免疫组化鉴定软骨细胞特性。结果 :从兔脂肪组织中能分离出生长旺盛的干细胞 ,CD3 4 抗原表达阳性 ,表达百分比与骨髓干细胞无明显差异 ;定向诱导后表现出软骨细胞的特性 ,诱导效果无血清诱导培养基效果最好。结论 :从兔脂肪组织中能分离出干细胞 ;生物学特性与骨髓干细胞相似 ;能向软骨细胞方向诱导 ;无血清诱导培养基效果最好。     

骨髓基质干细胞成骨能力的实验研究

目的:研究以骨髓基质干细胞(Bonemarrowstemcells,BMSCs)为种子细胞,海绵状脱钙骨基质(Demineralizedbonematrix,DBM)为细胞载体的组织工程块修复骨缺损的能力。方法:从兔股骨分离出的骨髓细胞经体外诱导分化条件培养,检测碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原的表达及钙结节的形成。将培养分化的兔BMSCs经5-溴-2'-脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2'-dexyouridine,BrdU)标记后接种到兔海绵状脱钙骨基质(spongeofDBM,sDBM)支架上,细胞接种密度为每块DBM种植(4～6)×106个细胞,然后分别植入兔背部肌肉内及兔桡骨中段10mm长的骨膜骨缺损内。对照组为骨缺损内单纯植入sDBM及空白组。术后观察6周。结果:经条件培养的BMSCs体外表达碱性磷酸酶、Ⅰ型胶原及形成钙结节。体内异位植入含BMSCs的组织工程骨块可形成新骨组织,成骨方式类似软骨化骨。体内骨缺损修复实验结果显示组织工程骨块与单独sDBM均在6周完全修复骨缺损。新生骨骨密度测量组织工程骨块植入组虽然均值高于单独sDBM植入组,但差异无显著性意义(t=2.289,P=0.071)。极限压缩强度测量显示,组织工程骨块植入组新生骨生物力学强度已达正常桡骨的90%,与正常桡骨段差异无显著性意义(t=2.893,P=0.0623);单纯sDBM植入组新生骨在生物力学强度为正常桡骨的86%。新生骨矿化率结果显示     

化学去细胞法对粗大神经质量评价方法及影响因素的探讨

目的 通过对粗大神经去细胞方法的研究，探讨对去细胞神经评价和制备的适宜方法。方法 取杂种犬3只，切取5段直径6mm的新鲜坐骨神经，每段长50mm，在3％ Triton-100和7％脱氧胆酸钠溶液中去细胞处理。实验分为5组：Ⅰ组，去细胞2遍；Ⅱ组，去细胞3遍；Ⅲ组，去细胞4遍；Ⅳ组，神经段两端用4号缝合线结扎后去细胞2遍；Ⅴ组，神经段两端用4号缝合线结扎后去细胞3遍。另设对照为未经处理的新鲜犬坐骨神经。从去细胞程度、基底膜板层素（Laminin）活性、脱髓鞘程度及神经纤维管道完整性4个方面进行评价。结果 所有实验组神经段去细胞完全，Laminin活性保存完好。髓鞘染色评分以Ⅳ组和Ⅴ组最低，纤维管道完整性评分以Ⅰ组和Ⅳ组最佳。综合评价对于粗大神经的去细胞处理方法以Ⅳ组处理方法最佳。结论 化学去细胞的神经脱髓鞘程度与去细胞次数不平行。在去细胞神经的质量控制中，应考虑基底膜Laminin的活性、去细胞、脱髓鞘及结构完整性的程度。对于粗大神经的处理，结扎神经段两端后再行去细胞处理可能是一种较好的方法。     

不同结构骨块植入股骨头负重区缺损的力学性能比较

目的股骨头缺血坏死早中期手术中,为防止股骨头的进一步塌陷,常需要植骨填充坏死区。本文研究不同结构植入物填充股骨头负重区缺损后对股骨头力学性能的影响。方法选取人正常股骨近段4例,在股骨头负重区沿压力骨小梁方向制造直径20mm,深30mm的骨缺损,并在缺损区内植入三种不同结构的植入物。Ⅰ组为取自异体股骨头负重区骨块;Ⅱ组为取自异体股骨髁负重区骨块;Ⅲ组为松质骨粒打压植骨。模拟单腿站立相加载,记录股骨头颈结合部的应变分布。结果直径20mm深30mm骨缺损的股骨近段与正常相比,头颈结合部上方拉应变平均增加93.0%,下方压应变平均增加203.4%。植入不同结构的植入物后,Ⅰ组头颈结合部上方应变较正常平均增加6.6%,下方应变平均增加67.6%;Ⅱ组上方应变较正常平均增加33.7%,下方应变平均增加136.9%;Ⅲ组上方应变平均增加150.4%,下方应变平均增加206.1%。结论股骨头负重区的缺损会改变头颈结合部应力分布,其中结合部下方和上方出现应力的集中。植入与缺损区的骨小梁结构相似的异体股骨头骨块后,股骨头下方和上方头颈结合部的应力集中得到缓解,其植入效果优于骨小梁结构不同的股骨髁骨块;松质骨粒打压植骨不能改变股骨头头颈结合部的应变分布。     

化学去细胞同种异体神经移植的临床研究

目的 评价去细胞同种异体神经移植修复人体周围神经缺损的疗效.方法 应用去细胞同种异体神经移植修复21例周围神经损伤缺损的患者,术后定期对患者进行感觉、运动功能及肌电图检查评估,并进行统计学分析.结果 平均随访时间39.2个月,总体优良率为71%.疗效优组8例中最长移植长度为8cm,平均长度为(4.8±2.6)cm,良组7例中最长移植长度为9 cm,平均长度为(6.3±2.6)cm,其移植长度大于优组.钝性伤8例中2例恢复优良,锐性伤8例中6例恢复优良.结论 应用化学去细胞同种异体神经移植修复人体周嗣神经缺损具有良好的疗效;近端粗大神经疗效较远端神经疗效好.感觉神经恢复良好.移植长度和神经损伤性质(钝性伤,锐性伤)对预后评估可能有影响.