大鼠GAD65基因的克隆与原核表达

目的构建pGEX-6P-3/GAD65原核表达载体,获得大量纯化的大鼠GAD65蛋白。方法通过RT-PCR技术从大鼠脑组织中扩增GAD65cDNA,克隆至PGEM-Teasy载体上并测序,利用引物上的BamHI与EcoRI酶切位点将GAD65基因插入PGEX-6P-3,转化大肠杆菌BL21,限制性内切酶消化鉴定。IPTG诱导重组菌株表达,用SDS-PAGE与Western-blot对表达产物进行鉴定,并用Sepharose4B亲和层析柱对表达产物进行纯化,PreScissionProteas酶对融合蛋白进行酶切。结果扩增的GAD65长度为1758bp,测序结果与已知序列吻合。重组子经酶切鉴定,获得PGEX-6P-3GAD65原核表达菌株,获得分子量约91000的PGEX-6P-3/GAD65融合蛋白,分离纯化出约65000的GAD65蛋白,Western-blot表明重组蛋白能被GAD65单克隆抗体特异结合。结论成功获得GAD65蛋白,为研究GAD65生物学作用奠定了基础。     

丰富环境对局灶性脑梗死大鼠旷场和水迷宫行为学及Nogo-A蛋白表达的影响

目的探讨丰富环境对局灶性脑梗死大鼠运动功能、学习记忆及Nogo-A蛋白表达的影响。方法手术组予线栓法制作SD大鼠右侧大脑中动脉缺血模型,术后24 h随机分为丰富环境组和标准环境组,分别饲养于普通鼠笼及丰富环境鼠笼;另设假手术组,不线栓大脑中动脉,其余步骤与手术组相同。各组分别在术后7、14、28 d分别用旷场实验、水迷宫实验进行行为学分析。术后28 d行为学分析后取脑,行免疫组化观察各组Nogo-A阳性细胞表达情况。结果术后28 d丰富环境组的运动总路程[(4 360±854)cm]与标准环境组[(2 362±694)cm]比较,差异有统计学意义(P<0.001)。定位航行实验,丰富环境组在术后14、28 d的潜伏期[分别为(33.0±5.8)s、(24.5±3.1)s]与标准环境组[分别为(46.6±6.0)s、(35.6±4.7)s]比较,差异有统计学意义(P<0.001)。空间探索实验,丰富环境组在术后28 d的穿越平台次数[(6.6±1.9)次]与标准环境组[(3.2±1.5)次]比较,差异有统计学意义(P<0.001)。丰富环境组梗死灶周围Nogo-A阳性细胞数(86.7±6.7)与标准环境组(117.5±8.3)比较,差异有统计学意义(P<0.001)。结论丰富环境能促进脑梗死大鼠的运动能力、记忆力的恢复。丰富环境能降低脑梗死大鼠梗死灶周围Nogo-A蛋白表达,从而促进神经再生。     

γ-氨基丁酸能神经元在新生大鼠缺氧性痫性发作中的作用

目的 通过观察新生大鼠早期发育过程中及缺氧性痫性发作后海马组织病理改变以及原癌基因c-fos蛋白、谷氨酸脱羧酶(glutamate decarboxylase,GAD)的变化,探讨γ-氨基丁酸(γ-amino butylic acid,GABA)能神经元在缺氧性痫性发作中的作用及可能的影响机制.方法 采用出生后10d的SD大鼠建立改良Jensen缺氧诱导痫性发作模型,分为痫性发作后1d、3d、7d、14d 4组,并选取相应时间点正常大鼠为对照组,采用尼氏染色方法检测海马组织的组织病理变化,免疫组织化学法检测各组海马c-fos蛋白灰度值以及GAD阳性神经元数量的改变.结果 尼氏染色结果显示,各缺氧性痫性发作组海马区形态结构正常,细胞排列略稀疏,但未见明显的细胞丢失.免疫组化结果显示,与对照组比较,c-fos蛋白灰度值在痫性发作后7d,在缺氧性痫性发作组海马CA2、CA3和DG区明显地降低(P ＜0.05);GAD阳性细胞数在痫性发作后7～ 14d,缺氧性痫性发作组海马CA1、CA3和DG区明显地减少(P＜0.05).结论 缺氧性痫性发作后14d内并没有造成大鼠海马区及时或迟发性细胞丢失,但c-fos表达在大鼠海马区有迟发性增高;缺氧性痫性发作后海马GABA神经元数量的减少可能是新生大鼠缺氧诱导痫性发作后癫痫易感性升高的原因之一.     

FMR1基因敲除小鼠脑组织微白蛋白表达的改变及其意义

目的 探讨微白蛋白(PV)阳性中间神经元在脆性X综合征(FXS)癫痫易感性增加中的作用. 方法 应用免疫组织化学染色检测FVB近交系雄性2、4、6 W龄FMR1基因敲除型(KO)(KO2W、KO4W、KO6W)和同龄野生型(WT)(WT2W、WT4W、WT6W)小鼠大脑纹状皮质、颞听皮质、梨状皮质及海马CA1区、CA3区、齿状回中PV的表达(n=6);应用Western blot法检测上述小鼠大脑皮层、海马组织PV的含量(n=6). 结果 KO2W、KO44W小鼠的大脑纹状皮质、颞听皮质、梨状皮质、海马CA1和CA3区PV阳性中间神经元的数量分别较WT2W、WT4-小鼠减少,差异有统计学意义(P<0.05);KO2W和KO4W小鼠大脑皮层、海马中PV含量分别较WT2W、WT4W小鼠减少,差异有统计学意义(P<0.05). 结论 PV阳性中间神经元及PV含量的减少.可能是引起FXS模型鼠癫痫易感性增加的主要原因.     

口服重组GAD65蛋白延缓NOD小鼠Ⅰ型糖尿病发生

目的研究重组GAD65蛋白对NOD小鼠Ⅰ型糖尿病的预防作用。方法6周龄NOD雌鼠3次/周灌胃重组GAD65蛋白,共6~56周,观测胰岛炎和糖尿病发病情况。结果重组GAD65蛋白能明显降低NOD小鼠糖尿病的发生和胰岛炎的严重程度。结论口服重组GAD65蛋白能预防NOD鼠糖尿病。     

新生大鼠缺血缺氧后胶质性谷氨酸转运体的表达及GM1的干预研究

目的探讨新生大鼠缺血缺氧性脑损伤后胶质性谷氨酸转运体的表达及神经节苷脂（GM1）的干预作用。方法通过建立新生大鼠缺血缺氧性脑损伤动物模型，应用免疫组化方法，观察缺血缺氧后不同时期大脑皮质胶质性谷氨酸转运体EAATI、EAAT2的动态表达度GM1对其表达的影响。结果缺血缺氧后6hEAAT1的表达开始上升、第2d达高峰，第3d恢复到假手术组水平；EAAT2的表达在缺血缺氧后12h开始上升，第3d达高峰，第5d恢复到假手术组水平；GM1干预组脑组织损伤明显减轻，EAAT1和EAAT2的表达较单纯缺血缺氧组显著增加（P〈0．01），持续时间延长。结论缺血缺氧诱导胶质性谷氨酸转运体的表达，GM1提高胶质性谷氨酸转运体的表达可能是GM1脑保护作用的重要机制之一。     

143例广东籍汉族人转化生长因子TGFβ1T869C基因多态性检测

目的 了解广东籍汉族人转化生长因子TGFβ1 T869C基因的分布特点.方法 应用聚合酶链反应技术对143例广东籍正常人转化生长因子TGFβ1 T869C基因进行扩增,以PstΙ进行限制性内切酶酶切图谱分析,并结合文献进行了不同地区间的分析比较.结果 转化生长因子TGFβ1＋869 C/C、C/T、T/T表型频率分别为：0.216 8、0.475 5、0.307 8,转化生长因子TGFβ1＋869 C、TGFβ1＋869T基因频率分别为：0.454 5、0.545 5.结论 转化生长因子TGFβ1 T869C基因多态性在不同地区间分布存在着一定的差异.     

缺血性脑梗塞CT表现与梗塞后神经细胞凋亡及坏死的相关性

目的 探讨实验性缺血性脑梗塞早期CT表现与神经细胞损伤的相关性及与临床诊断、治疗、预后的关系。方法 将新西兰大白兔经颈总动脉注入PVA栓子栓塞大脑中动脉，在不同的时间点(2～36h)对免脑进行CT扫描，并取脑组织经：HE染色、Nissle染色、免疫组化(TUNEL法)进行观察。结果 CT分期Ⅰ期(脑梗塞后2～8h)，神经细胞首先出现缺血改变，随后细胞周围出现水肿：基底节周围及大脑皮质可见少量TUNEL阳性细胞。CT分期Ⅱ期(梗塞后12～18h)，以神经细胞溶解消失为主：基底节周嗣及大脑皮质可见较多TUNEL阳性细胞。CT分期Ⅲ期(梗塞后24～36h)，脑水肿改变十分显著，基底节呈明显的坏死区，神经细胞坏死，结构消失．大脑皮质可见大量TUNEL阳性细胞。神经元具有凋亡及坏死的双重形态学特征。结论 缺血性脑梗塞后神经细胞损伤形态上有水肿、凋亡及坏死等多样性，CT扫描显示缺血性脑梗塞的进展与实际病理变化有高度相关性。     

基质金属蛋白酶9C1562T基因突变频率的检测

目的：建立一种简便、准确、实用的人基质金属蛋白酶9C1562T基因突变频率的检测方法,并了解汉族人基质金属蛋白酶9C1562T基因的分布特点.方法：115例广东籍汉族人血样本取自2004年9月广州医学院卫生所体检的正常人,应用聚合酶链反应（PCR）特异性扩增人基质金属蛋白酶9C1562T基因序列,扩增产物用限制性内切酶SphⅠ酶切,琼脂糖凝胶电泳后,观察酶切位点的限制性片段长度多态性（RFLP）图谱.结果：运用PCR-RFLP法检测了115名广东籍汉族人基质金属蛋白酶9基因C1562T点突变,其中野生型纯合子频率为87.83%,杂合子频率为10.43%,突变型纯合子频率为1.74%.突变等位基因频率为0.0694.结论：该方法简便、快速、准确,适合于一般实验室检测及大规模的人群调查,汉族人基质金属蛋白酶9C1562T基因的分布与其他地区人群的分布无明显差异.     

大鼠脑缺血再灌流期海马内缩胆囊素的动态变化

本实验采用免疫组化技术，研究了脑缺血及再灌流各阶段大鼠海马内缩胆囊素（CCK）的变化，再灌流后6～24h，海马CCK阳性神经元有所增多，再灌1天后CCK阳性细胞有所减少，至第4～7天时CCK阳性神经元减少更明显，脑缺血性改变于再灌流6h以前呈现加重趋势，1天后乃逐渐改善，至第4～7天时CA2～4区的缺血变化显著减轻，而在CA1区，随着再灌流期延长，其缺血性变化不仅不改善，反而加重直至部分锥体细胞死亡。提示：CCK的大量释放可能与脑缺血再灌流神经损害有关。