iPSC-MSC来源的外泌体对LPS刺激肺泡巨噬细胞产生炎性因子的影响

目的探讨i PSC-MSC来源的外泌体(exosome,Exo)对LPS刺激的肺泡巨噬细胞释放炎性因子的作用。方法采用旋转超滤法提纯i PSC-MSC外泌体,以无外泌体培养基培养肺泡巨噬细胞NR8383,分别给予Exo(50μg/ml)、LPS(50ng/ml)、LPS(50ng/ml)+Exo(50μg/ml)培养24h,以不含Exo和LPS培养为对照组,利用酶联免疫标记法(ELISA)检测各组上清液中TNF-α、IL-1β、IL-6蛋白浓度。结果提取物经透射电镜观察为圆形或半圆形囊泡,直径40~100nm,表达Exo标志物CD9和CD63;LPS组上清液中TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度(435.38±36.31pg/ml、319.76±39.14pg/ml和408.33±43.44pg/ml)与空白对照组(37.48±8.75pg/ml、33.51±7.88pg/ml和37.73±8.46pg/ml)和Exo组(38.71±9.14pg/ml、32.05±6.81pg/ml和42.84±6.54pg/ml)比较显著上调(P0.01);LPS+Exo组TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度(369.30±32.74pg/ml、249.23±36.77pg/ml和328.91±46.45pg/ml)与LPS组相比,明显减少(P0.05);空白对照组与Exo组的TNF-α、IL-1β和IL-6的浓度无显著性差异。结论成功富集Exo;i PSC-MSC来源的Exo可抑制LPS诱导的肺泡巨噬细胞表达炎性因子。     

氯化镧阻断LPS诱导巨噬细胞钙信号通路激活及TNF-α释放

目的探讨氯化镧(LaCl3)对脂多糖(Lipopolysaccharide,LPS)诱导巨噬细胞钙信号通路激活及肿瘤坏死因子α(TNF-α)释放的影响。方法将巨噬细胞RAW 264.7随机分成四组:LPS组(培养液中含1μg/ml LPS),LaCl3+LPS组(以含2.5μmol/ml LaCl3的培养基孵育细胞一定时间后,再予以1μg/ml LPS刺激),LaCl3组(培养液中含2.5μmol/ml LaCl3)及对照组(培养液中不含LaCl3和LPS)。于不同时间点分别收集各组细胞及其培养上清待测。以Fluo-3/Am加载细胞,经上述不同分组处理一定时间后,流式细胞术观察细胞内Ca2+浓度([Ca2+]i)的变化;采用酶联免疫吸附试验(ELISA)检测上清中TNF-α水平。结果流式细胞术测定结果显示:LPS组细胞内[Ca2+]i为(336.67±26.16nmol/L),与对照组比较差异显著(P0.01);LaCl3+LPS组(162.67±26.41nmol/L)显著低于LPS组(P0.01);LaCl3组(29.84±6.42nmol/L)与对照组相比略低但无统计学意义(P0.05)。LPS组细胞培养上清TNF-α含量(152.19±15.68pg/ml)与对照组相比,显著升高(P0.01);而LaCl3+LPS组细胞培养上清中TNF-α含量为43.95±6.55 pg/ml,与LPS组相比显著下降(P0.01)且与对照组相比无差异;LaCl3组细胞培养上清中TNF-α含量(27.84±3.73pg/ml)与LPS组相比显著下调(P0.01),并且与对照组相比亦显著下调(P0.05)。结论一定浓度的LaCl3可阻断LPS诱导巨噬细胞钙信号通路激活及抑制TNF-α的释放。     

大鼠真皮多能干细胞分离培养及其多分化潜能特性

目的建立分离培养大鼠真皮来源多能干细胞（SKPs）的方法并探讨其生物学特性。方法0．25％中性蛋白酶（protease）选择性的消化表皮与真皮的细胞连接，剥离真皮，采用0．25％的胰蛋白酶消化真皮层细胞于超低黏附培养板中进行悬浮无血清培养，机械法传代，免疫荧光染色法检测细胞表面分子的表达，体外诱导其向脂肪细胞分化，研究其多分化潜能。结果体外培养2～3d后真皮多能干细胞聚集成球悬浮生长，培养4代后去除生长因子后并添加血清培养，细胞帖壁生长，呈长梭形成纤维样，免疫荧光染色显示，体外培养的真皮多能干细胞可表达CD29和Nestin，不表达CD34与vimentin。体外诱导实验结果显示体外培养的真皮多能干细胞能够被诱导成脂肪细胞，油红染色阳性。结论采用悬浮培养方法可成功分离培养大鼠真皮多能干细胞，培养的细胞可表达神经干细胞标志并具有多分化潜能。     

尿道修复材料的研究及应用进展

尿道修复材料是尿道修复重建成败的关键,将尿道的修复材料分为自体组织材料、人工合成材料及组织工程化材料,从实验室和临床2方面对尿道修复材料的研究及应用进展进行综述.     

骨髓间充质干细胞移植对脑缺血区微血管增生及Notch1表达的影响

目的 观察骨髓问充质干细胞(BMSC)移植对脑缺血皮质区血管形成的影响及微血管Notch1表达的变化.方法 用线栓法复制大鼠脑缺血再灌注损伤动物模型.随机分为假手术对照组、单纯脑缺血损伤组和脑缺血后BMSC移植组.采用免疫组织荧光染色法检测各组缺血皮质区Ⅷ因子及Notch1的表达.结果 (1)植入的BMSC可以趋向性迁移到脑缺血损伤区域.(2)BMSC移植组脑缺血皮质区新生微血管密度较单纯脑缺血损伤组和假手术对照组明显增高.(3)BMSC移植组缺血皮质区多数微血管内皮细胞阳性表达Notch1,且明显多于单纯缺血组和假手术对照组.结论 BMSC移植可促进脑缺血区血管新生,且可能与促进Notch1表达有关.     

大鼠非细菌性前列腺炎模型的复制

目的探讨大鼠非细菌性前列腺炎模型的制备方法,为非细菌性前列腺炎的治疗研究提供组织学依据。方法将弗氏完全佐剂(CFA)直接注射SD(Sprague-Dawley)雄性大鼠前列腺内,手术后3、7、10 d分批解剖,进行外观和组织学观察。结果形成典型的非细菌性前列腺炎动物模型。结论弗氏完全佐剂(CFA)可以成功制做大鼠非细菌性前列腺炎,为本病的治疗提供一种可靠的动物模型,并为本病的进一步研究提供一条实验性途径。     

miRNA－92a在缺血再灌注肾损伤中的表达变化

目的 观察miRNA-92a在缺血再灌注(I/R)损伤4h、24h后小鼠肾组织的表达变化,探讨肾脏缺血损伤后血管生成的可能机制.方法 采用双侧夹闭小鼠肾蒂的方法 制备急性缺血再灌注肾损伤模型,术后灌注24h后收集血清和肾脏标本,分别检测肾功能及观察肾组织病理学改变.实时定量逆转录聚合酶链反应(real-time RT-PCR)的方法 检测小鼠I/R损伤4h和24h组中miRNA-92a的表达水平.结果 (1)采用血清肌酐(Scr)和尿素氮(UN)评估肾功能,肾脏I/R 24h组与假手术组(sham)比较有显著性差异(P<0.05);HE染色观察肾组织病理改变明显,肾缺血再灌注模型成功.(2)而I/R4h和24h后,miRNA-92a的表达上调,其上调倍数分别为3.23±0.74,1.53±0.33 (P<0.05).结论 小鼠I/R损伤中miRNA-92a表达显著上调,miRNA-92a可能参与缺血再灌注肾组织损伤的血管再生的调控过程.     

人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化及相关基因时序表达的影响

背景：大量有关动物的体内外研究表明,骨髓间充质干细胞在心肌微环境或模拟心肌微环境的作用下可分化为心肌细胞。然而,类似的人类研究报道较少,同时相关的分化机制也不甚清楚。目的：探讨人类心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞诱导分化的影响及相关基因的时序表达。方法：体外分离培养人类骨髓间充质干细胞,传至第4代加入自体心肌匀浆上清液诱导骨髓间充质干细胞,持续作用2周。相差显微镜下观察骨髓间充质干细胞形态变化,免疫荧光方法鉴定心肌特征性肌动蛋白α和肌钙蛋白的表达,应用半定量RT-PCR技术分析Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC、肌钙蛋白等相关基因在分化过程中的动态时序表达。结果与结论：经心肌匀浆上清液诱导后,骨髓间充质干细胞体积变大,立体感增强,形态近似棒状。诱导2周时肌动蛋白α及肌钙蛋白阳性细胞比例分别为25.53%和23.48%。Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C基因在诱导后3 d表达开始增强, 其中GATA-4、MEF-2C诱导后5 d达高峰,以后维持在较高水平,Nkx-2.5则随诱导时间逐渐增强;α-MHC、肌钙蛋白基因诱导前无表达,于诱导第3天出现表达,以后维持在高水平。结果提示,心肌匀浆上清液对骨髓间充质干细胞具有定向诱导作用,在此过程中,伴随着Nkx-2.5、GATA-4、MEF-2C、α-MHC和肌钙蛋白基因的时序表达变化。     

大鼠肺组织胞外囊泡对脓毒症肺内炎症及中性粒细胞胞外诱捕网形成的影响北大核心CSCD

目的探讨脓毒症大鼠肺组织来源的胞外囊泡对脓毒症肺内炎症反应及中性粒细胞胞外诱捕网(neutrophil extracellular traps,NETs)形成的影响。方法采用盲肠结扎穿孔术(cecal ligation and puncture,CLP)建立脓毒症大鼠模型,利用Collagenase D和DNase I充分酶解消化肺组织,多次离心去除杂质,最后通过差速超速离心法提取肺组织胞外囊泡(Ti-EVs)。将18只雄性SD大鼠随机分为3组:Ti-EVs组行CLP术并经气道滴入Ti-EVs混悬液(2.5 mg/kg);CLP组行CLP术并经气道滴入等体积PBS;Sham组行假手术。24 h后利用苏木精-伊红(HE)染色检测肺组织病理学变化,酶联免疫吸附实验检测肺泡灌洗液(bronchoalveolar lavage fl uid,BALF)中IL-1β、TNF-α及IL-6的表达水平,免疫荧光法检测肺组织内NETs含量。结果分离提取的大鼠肺组织胞外囊泡经透射电镜观察为双层圆形的囊性小泡结构,粒子直径主要分布在150 nm,Western blot显示EVs标志物CD9、CD63、Tsg101呈阳性表达。肺组织HE染色可见脓毒症大鼠肺泡完整性破坏,炎症细胞浸润。与CLP组相比,Ti-EVs组肺组织损伤程度更重,且BALF中IL-1β、TNF-α、IL-6炎症因子表达水平均显著升高(P<0.01);激光共聚焦显微镜下见脓毒症组和Ti-EVs组肺内均有NETs形成,Ti-EVs组肺内NETs荧光强度较脓毒症组明显增加。结论通过酶解消化、差速超速离心等系列步骤能够成功分离提取得到纯度较高的大鼠肺组织胞外囊泡。在脓毒症肺损伤进程中,肺组织胞外囊泡可加重肺内炎症反应,促进NETs形成。     

小鼠真皮多能干细胞在缺血性损伤脑组织移植后的分布与分化

目的探讨小鼠真皮多能干细胞(SKP)经股静脉移植后在缺血性损伤脑组织中的分布及分化情况。方法分离培养绿色荧光蛋白转基因小鼠(C57BL/6-gfp)SKP,随机选取5只同基因型小鼠采用线栓法制作局灶性大脑中动脉栓塞(MCAO)模型,缺血2h后行再灌注,再灌注24h后将C57BL/6-gfp来源的SKP经小鼠股静脉输入动物模型体内,植入后第7天处死小鼠,作冷冻切片,采用免疫组织荧光染色法,检测SKP在脑缺血小鼠体内的分布及分化情况。结果移植SKP7d后,MCAO小鼠脑组织冷冻切片在荧光显微镜下可见移植的SKP主要分布在缺血灶周围,且这些细胞表达胶质纤维酸性蛋白(GFAP)和神经元特异性烯醇化酶(NSE)。结论经股静脉移植的SKP主要分布在MCAO模型鼠脑缺血损伤区周围,并可向神经细胞分化。