Lentivirus介导表达多基因的人胚基因工程神经干细胞的实验研究

目的：探索以Lentivirus为载体，构建同时携带并表达多基因的基因工程人胚神经干细胞(human neural stem cell，hNSC)的可行性，为脊髓损伤治疗的研究提供材料。方法：培养和鉴定hNSC：用携带绿色荧光蛋白(green fluorescence protein，GFP)和神经营养因子-3(neurotrophic factor-3，NT-3)的Lentivirus转染hNSC；用荧光显做镜观察、鼠胚背根神经结培养(dorsal root ganglion，DRG)和Slot blot等方法检测基因工程hNSC的多基因表达情况。结果：培养获得了大量的hNSC；荧光显微镜观察到几乎100％的hNSC表达GFP：基因工程hNSC的培养液能促使大鼠DRG旺盛生长；Slot blot检测到基因工程hNSC能高效分泌NT-3蛋白。结论：以Lentivirus为载体能构建同时携带并稳定表达多基因的基因工程hNSC．为脊髓损伤治疗的基础研究及进一步临床应用提供了有价值的细胞资源。     

人胚神经干细胞的长期体外培养

目的：建立人胚神经千细胞（human Neural Stem Cells、hNSC）的体外培养体系。方法：选取3个月～4个月大的引产胎儿，分离原代人胚神经千细胞、添加碱性成纤维细胞生长因子（bFGF）、N2促进hNSC的增殖，使用免疫细胞化学方法与诱导分化实验鉴定其神经千细胞的特性。结果：成功培养出人胚神经干细胞、原代培养的hNSC悬浮生长，似桑椹状，表达巢蛋白（Nestin）抗原，诱导分化后可表达神经元与神经胶质细胞特异抗原βⅢ与神经胶质细胞特异抗原GFAP，并能自我增殖：目前已成功传代10余次（5月余）。结论：使用本方法可以获得大量纯化hNSC？为临床实验提供适合的移植材料。     

一期经前路病灶清除、自体髂骨植骨内固定治疗腰骶椎结核

目的探讨前路一期病灶清除、自体髂骨植骨、单枚自锁钛板内固定治疗腰骶椎结核的临床疗效。方法采用经前方入路、2枚适宜大小的自体髂骨块移植植骨、单枚自锁钛板前方内固定治疗9例腰骶段结核患者,术前异烟肼、利福平、吡嗪酰胺、乙胺丁醇四联抗结核治疗至少2周,待ESR控制在35mm/1h以下、体温恢复正常后行手术治疗。结果患者均获得随访,时间12~68个月。末次随访时患者结核症状均消失、ESR恢复正常。腰骶角:术后24.3°~35.1°,末次随访时23.7°~34.0°。患者均获得Ⅰ级骨融合,未发生植骨块移位及钛板、螺钉松动或断裂。神经功能Frankel分级:1例C级恢复至D级,4例D级均恢复至E级。结论前路一期病灶清除、自体髂骨植骨、单枚自锁钛板内固定治疗腰骶椎结核安全、有效,骨融合良好,重建腰骶段稳定性,畸形矫正维持良好。     

构建人端粒酶反转录酶基因腺相关病毒2载体在人髓核细胞的表达

背景：动物研究显示,自体髓核细胞移植能有效修复椎间盘退变。然而髓核细胞体外增殖能力差,这就限制了其作为种子细胞在椎间盘退变性疾病治疗中的研究及应用。 目的：构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2载体,观察其转染人髓核细胞后人端粒酶反转录酶基因的表达。 方法：构建pSNAV2.0-pRSV-hTERT质粒并鉴定,采用AAVMaxTM包装系统进行重组腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体的构建,以PCR及酶切方法验证构建的质粒,构建成功后扩增,并纯化。利用腺相关病毒2-增强型绿色荧光蛋白载体转染第1代人髓核细胞,测定最佳感染复数。参照此感染复数值,确定腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶对人髓核细胞转染的相关感染复数;对照组采用不含外源性人端粒酶反转录酶基因的腺相关病毒2进行转染。转染后1,2,4周分别采用RT-PCR对人端粒酶反转录酶基因mRNA水平进行半定量检测。 结果与结论：实验成功构建了腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体;并获得了滴度达2×10¹¹ v•g/mL的腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体。测得腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶载体对人髓核细胞的最佳感染复数为5×10⁴ v•g/cell。在以1×10⁴,5×10⁴,1×10⁵ v•g/cell转染人髓核后,均可检测到人端粒酶反转录酶基因mRNA的高量表达。采用RT-PCR半定量检测方法,发现以转染后2周时人端粒酶反转录酶 mRNA表达量相对最高(P < 0.05),4周时仍可见人端粒酶反转录酶基因mRNA的稳定表达。而对照组无论在何时间点均未能检测到人端粒酶反转录酶mRNA的表达。提示利用腺相关病毒2可以成功构建包含外源性人端粒酶反转录酶基因的病毒载体,腺相关病毒2-人端粒酶反转录酶能有效转染人髓核细胞并稳定表达人端粒酶反转录酶基因mRNA,此结果可能为增强髓核细胞性能提供新的策略。 中国组织工程研究杂志出版内容重点：组织构建;骨细胞;软骨细胞;细胞培养;成纤维细胞;血管内皮细胞;骨质疏松;组织工程全文链接：     

急性创伤型腰4椎体V°滑脱1例

患者,男,19岁。因7d前弯腰挖煤 时被近半吨重煤块击伤腰部,当即感腰 痛难忍,活动明显受限,双小腿不能活 动,二便不能自解。于2003-05-06由外 院转入我科。入院查体:一般情况尚好, 急性痛苦面容,平卧困难,腰部活动受限     

The experimental study of genetic engineering human neural stem cells mediated by lentivirus to express multigene

Thefunctionalrepairofspinalcordinjury(SCI)isoneofthedifficultprobleminmedicine.Because,ontheonehand,largenumbersofthefunctionalcellsdieduetoprimaryinjuryandsecondary pathophysiologicchangesinvivoafterSCI,suchas ischemia,edema,inflammationandsoon;onthe otherhand,thelackofsufficienttrophicsupport1,2resultsinfailureofaxonregeneration,namely“abortiveregeneration”,3therefore,howtoadjustthe inappropriatemicroenvironmentinvivoafterSCIisan urgentproblemforthefunctionalrepairofSCI.NSCs(neuralste…     

AF椎弓根钉系统治疗胸腰椎骨折脱位

目的：探讨AF椎弓根钉系统治疗胸腰椎骨折脱位的手术疗法，临床疗效及优缺点。方法：回顾性分析了AF椎弓根钉系统治疗胸腰椎骨折脱位26例患者手术前后的临床表现、X线和CT扫描测量结果。结果：胸腰椎骨折脱位经AF系统治疗后复位满意，内固定牢固，脊柱稳定性及椎管重建好，不全瘫患者神经功能均有不同程度的恢复。结论：AF椎弓根钉系统是治疗胸腰椎骨折脱位的一种好方法。     

Ⅱ型胶原糖胺聚糖复合支架对 hUCM SCs成软骨诱导的实验研究

目的：探讨以人脐带间充质干细胞（hUCMSCs）作为软骨组织工程种子细胞,Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料作为细胞载体及其细胞‐支架复合体成软骨的可行性。方法制备Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖多孔支架,电镜观察测定支架材料的孔径、孔隙率和亲水性,对支架材料进行相应的组织学分析。培养鉴定 P3代的hUCMSCs ,将hUCMSCs混悬液接种到Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架上,不加诱导剂进行培养,3周后取出样品行甲苯胺蓝、番红精O染色,Ⅱ型胶原免疫组织化学染色及扫描电镜观察。结果第3代hUCMSCs高度表达CD29、CD105等间充质细胞标志,几乎不表达CD34等内皮细胞、造血细胞标志。Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料呈白色多孔泡沫状,孔隙率为（91．8±2．17）％,孔径110～230μm ,分布均匀,相互贯通。吸水膨胀率为（213．71±1．31）％,亲水性良好。甲苯胺蓝、番红精O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色呈阳性。细胞‐支架复合体在培养过程中可观察到有软骨样组织形成并逐步增多,甲苯胺蓝、番红精O及Ⅱ型胶原免疫组织化学染色均呈阳性,电镜观察显示细胞在支架上增殖活跃,与材料黏附紧密,可见软骨样细胞及其周围大量交错连接的胶原纤维。结论 hUCMSCs与Ⅱ型胶原复合糖胺聚糖支架材料复合,可在体外不经诱导而初步构建组织工程软骨,为软骨损伤的修复奠定了一定的实验基础。     

颈椎前路钢板内固定治疗颈椎骨折脱位

目的探讨颈椎前路钢板内固定治疗颈椎骨折脱位的临床疗效。方法对2000～2007年采用颈椎前路减压、取髂骨植骨融合、前路自锁钢板内固定治疗的98例颈椎骨折脱位病例进行回顾总结。结果本组手术时间90—180min（平均130min）,出血量200～3000ml（平均400m1）,无术中并发症。76例获得随访的合并脊髓损伤的病例中,除30例A级者未见神经功能改善外,其余46例均有1～3级改善,平均改善1．7级。结论颈椎前路钢板内固定是治疗颈椎骨折脱位的确切、有效方法。     

后路短节段固定加减压融合治疗下腰椎创伤性滑脱

目的 探讨后路短节段椎弓根钉SRS系统内固定加减压融合治疗下腰椎创伤性滑脱的临床疗效.方法 下腰椎创伤性滑脱12例,采用椎弓根钉SRS系统复位内固定加减压融合治疗.结果 术后9例完全复位,2例残留Ⅰ度滑脱,1例残留Ⅱ度滑脱.术后随访1～34个月,平均11个月,结果优9例,良3例.结论 采用后路短节段椎弓根钉SRS系统加减压融合治疗下腰椎创伤型滑脱,具有复位满意,内固定牢固,不干扰邻近正常椎间节段等优点.