凝血及炎性因子检测在类风湿关节炎并发冠心病患者中的临床意义

目的探讨实验室凝血指标及相关炎性指标检测在类风湿关节炎(RA)并发冠心病(CHD)患者中的临床意义。方法选择2015年1月至2016年12月昆明医科大学第六附属医院住院患者为研究对象,按照疾病种类将研究对象分为RA并发CHD组、单纯RA组,单纯CHD组,同时选取健康体检者作为对照组,每组研究对象120例。分析各组抗环瓜氨酸抗体(ACCP)、类风湿因子(RF)、白细胞介素-6(IL-6)及凝血酶原时间(PT)、活化部分凝血活酶时间(APTT)、血浆纤维蛋白原(FIB)水平和凝血酶时间(TT)、D-二聚体(D-D)和纤维蛋白(原)降解产物(FDP)的水平。结果 RA并发CHD组中,RF、ACCP、IL-6水平均明显高于其他3组(P0.012 5);单纯RA组的RF、ACCP和IL-6水平与其他3组比较,差异均有统计学意义(P0.012 5);单纯CHD组RF、ACCP水平与单纯RA组和RA并发CHD组比较,差异有统计学意义(P0.012 5)。单纯RA组和RA并发CHD组的D-D、FIB、FDP水平与其他3组比较差异均有统计学意义(P0.012 5);单纯CHD组的D-D、FDP水平与单纯RA组和RA并发CHD组比较,差异有统计学意义(P0.012 5)。结论 ACCP、IL-6及凝血指标D-D、FIB、FDP的检测能及时反映RA并发CHD患者的病情发展及体内凝血和纤溶系统失衡情况,可在临床推广使用。     

降钙素原生物素-链霉亲和素酶联免疫吸附分析法的建立

目的建立生物素一链霉亲和素酶联免疫吸附分析（biotin．streptavidinamplifiedELISA,BA．ELISA）法半定量检测人血清中降钙素原含量。方法通过双抗体夹心法,结合生物素一链霉亲和素系统的放大作用,建立降钙素原的半定量检测方法。并对该试剂的各项性能指标进行评价。结果该方法的最低检测限为0．12mg／mE,线性范围为0．12～20ng／mL,回收率为98．59％。分析内和分析间变异系数分别为4．9％～16．8％和7．1％～14．9％。与降钙素原结构类似物及血清中常见的干扰物质特异性良好。通过对73例血清样本进行检测分析,当阈值为0．5ng／mL时,敏感性和特异性分别为100％和96．0％。结论本研究建立的降钙素原生物素一链霉亲和素酶联免疫吸附分析法具有灵敏、简便、准确等特点,具有良好的应用前景。     

DA8600测序平台对EGFR基因检测最低DNA用量的探讨

目的 基于DA8600测序平台,探讨AmpliSeq建库方法检测EGFR基因突变所需最低样本DNA用量,以评估下一代测序(next generation sequencing,NGS)检测技术的性能. 方法 本研究选择10例EGFR突变的石蜡包埋组织样本,分别取1 ng、5 ng、10 ng、20 ng样本DNA进行文库构建,使用DA8600半导体测序仪进行检测,并比较检测结果. 结果 10 ng和20 ng DNA用量均可全部准确检出EGFR基因突变;5 ng DNA用量准确检出7例EGFR基因突变,1例文库质量不合格无法进行测序,1例无法检出EGFR突变,1例测序数据量不足检测失败;1 ng DNA用量构建文库全部质量不合格,无法进行测序. 结论 通过对10例样本不同DNA用量构建文库的检测结果分析,说明10 ng DNA即可采用AmpliSeq建库方法在DA8600半导体测序仪进行EGFR基因突变检测.     

孕中期甲胎蛋白中位数的建立及临床应用研究

目的:建立孕14～20周甲胎蛋白(AFP)中位数.并使用唐氏综合征阳性病例进行验证分析.方法:使用AFP时间分辨免疫荧光法试剂检测21 278份正常单胎孕妇血清和21例唐氏综合征(DS)阳性孕妇血清.根据末次月经日期确定样本孕周,采用直接法计算AFP各孕周的中位数.以此为基础,计算阳性病例中倍数(MoM),并进行统计学分析.结果:AFP中位数水平与美国PE公司提供的白种人孕妇数据相比差异有显著性(P=0.000);分析DS病例,其母血AFP MoM值均值与正常孕妇相比差异有显著性(P=0.000).结论:本研究建立的中位数可以区分阳性和阴性病例,能有效应用于风险评估.     

AFP/CEA双标记时间分辨荧光免疫分析试剂的研制及性能鉴定

目的研制甲胎蛋白（AFP）及癌胚抗原（CEA）的双标记时间分辨荧光免疫分析（TRFIA）试剂,并鉴定其性能。方法将抗AFP单克隆抗体（E014）与抗CEA单克隆抗体（3E6）混合包被96孔板,用钐标记抗AFP单克隆抗体（E010）,铕标记抗CEA单克隆抗体（S001）,用双抗体夹心一步法建立AFP/CEA TRFIA试剂,测定其线性相关性、灵敏度、精密度、回收率、特异性,并与对应的单标记进口试剂进行比较。结果 AFP分析灵敏度为0.3 U/ml,线性范围为0.3~800 U/ml,平均回收率为99.8%,分析内和分析间变异系数分别为2.1%~5.8%、4.1%~8.7%;CEA分别为0.2 ng/ml、0.2~400 ng/ml、100.3%、2.4%~5.6%、4.8%~9.8%。该试剂与对应的单标记进口试剂的相关系数分别为0.99、0.98。结论成功研制了AFP/CEA双标记TRFIA试剂,其性能均达到临床检测要求,可替代国内外的单标记试剂。     

恶性疟原虫海南株(FCC1/HN)乳酸脱氢酶基因的分子克隆及序列分析

目的　了解恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)乳酸脱氢酶基因全编码区核苷酸序列变异情况。方法　PCR扩增恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)LDH基因全编码区 ,产物经EcoRⅠ +SalⅠ酶切后 ,定向克隆至pGEX - 4T - 1表达质粒 ,采用Sanger双脱氧链末端终止法测序 ,与其它生物LDH进行同源性分析。 结果　成功地扩增了恶性疟原虫海南株 (FCC1/HN)LDH编码基因 ,大小为 95 1bp ,无内含子 ,与Honduras株LDH基因相比 ,两者有 5个碱基不同 ,推导的氨基酸序列有 4个氨基酸残基不同 ,与刚地弓形虫、隐孢子虫和芽孢杆菌的同源性分别为 49.0 6 % (15 6 / 318)、42 .5 8% (132 / 310 )、31.6 1% (98/310 )。与人的LDH -A、LDH -B和LDH -C的同源性分别为 30 .19% (93/ 30 8)、2 9.5 5 % (91/ 30 8)和 33.44 % (10 4/ 311)。结论　FCC1/HN株与Honduras株LDH高度同源 ,疟原虫LDH明显不同于其它生物LDH     

人促卵泡激素光激化学发光免疫分析法的建立及性能评价

目的利用光激化学发光免疫分析法(AlphaLISA)建立人促卵泡激素(hFSH)的快速检测试剂。方法使用2株配对的hFSH单克隆抗体,一株hFSH单克隆抗体用生物素标记,另一株hFSH单克隆抗体包被于受体微球上,与包被有链霉亲合素的供体微球共同构成检测试剂,优化反应体系并对试剂的各项性能指标进行评价。结果自制hFSH试剂分析敏感性和功能敏感性分别为0.09和0.12 U/L,线性测量范围为0.09～192.00 U/L,试剂的分析内变异系数(CV)和分析间CV分别为4.2%～7.1%和7.5%～8.3%,均<10.0%,与人黄体生成素(hLH)、人促甲状腺素(hTSH)和人绒毛膜促性腺激素(hCG)的交叉率分别为0.16%、0.08%和0.02%。100份临床血清样本用本试剂与西门子Immulite 2000促卵泡生成激素化学发光(CLIA)检测试剂盒检测,其相关系数为0.979(P<0.001)。结论自制hFSH AlphaLISA试剂的各项性能指标均能达到临床检测要求,可用于临床血清样本hFSH浓度的测定。     

脑组织中神经酰胺、白细胞介素-1β、caspase-3在脑创伤后的改变和作用

目的 研究脑组织中白细胞介素－1β（IL－1β）、神经酰胺、caspase03在创伤性服损伤（TBI）后的改变和相互作用。方法 以大鼠自由落体脑损伤为模型，损伤前后各30min加用不同处理因素后24h，用于湿法测量服含水量，TUNEL染色检测神经细胞凋亡，ABC法检测caspase-3活性片段P20的表达，DAG激酶（diacylglcerol kinase,DAGK）法检测神经酰胺的变化。结果 TBI后双侧脑组织含水量、TUNEL染色阳性细胞、caspase-3活性片段、IL－1β有神经酰胺均较对照组显著增加。caspase－3抑制剂使TBI后TUNEL染色阳性细胞明显下降，对脑组织水和神经酰胺含量没有影响。IL－1β抗体使TBI活性片段下降，但明显弱于神经酰胺的降解剂鞘氨醇激酶（SK）的作用。而SK对TBI后脑组织中IL－1β的表达没有影响。结果 TBI后服组织中神经酰胺的大量合成在伤后的脑水肿和神经细胞凋亡中是一个主要信号途径。IL－1β是神经酰胺合成的刺激因素之一；caspase是神经酰胺的下游信号途径。     

一种灵敏的干血斑葡萄糖-6-磷酸脱氢酶荧光分析法的建立

目的 建立葡萄糖-6-磷酸盐脱氢酶(G6PD)荧光分析方法,用于新生儿足跟干血斑中G6PD酶活性的定量测定.方法 选择于血斑配制基质,优化底物、复溶物和铜试剂组分,建立G6PD荧光分析法定量检测方法,并对该试剂的各项性能指标进行评价.结果 自制试剂分析灵敏度为0.05 U/g Hb;分析内和分析间精密度分别为4.12%-8.93%、4.75%～9.86%:试剂的cutoff值为2.23 U/g Hb;1 066份样本用该试剂与PerkinElmer(PE)公司同类试剂平行榆测,两种试剂测值具有显著相关性(P=0.000),相关系数为0.960;以PE公司试剂为对照,本试剂的阳性符合率为99.4%,阴性符合率为98.93%.结论 该试剂灵敏度高、操作简便快捷,具有良好的精密度.临床检测性能良好,可以满足临床应用的需要.     

INHA基因的克隆表达以及多克隆抗体的制备

目的INHA的表达、纯化,以及多克隆抗体的制备。方法利用基因重组技术获得INHA基因以及去信号肽的INHA基因,将其都分别构建到原核表达系统并分离纯化得到相对分子质量为58000的带有组氨酸标签的重组INHA融合蛋白。用分离纯化后的INHA融合蛋白作为抗原免疫,获得抗INHA的多克隆抗体。结果成功地获得INHA基因,并且以包涵体的形式表达于大肠杆菌中,用间接酶联免疫吸附(ELISA)方法,Westernblot检测结果显示,该抗体能特异性地与INHA的抗原以及胎盘组织产生明显免疫亲和反应。结论建立原核高效稳定INHA表达系统,获得具有生物学活性的蛋白,为进一步获得高特异性的抗体奠定基础。