含GFP基因的逆转录病毒与VSV-G蛋白重组形成高滴度假病毒

目的通过与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)蛋白重组,提高含绿色荧光蛋白(GFP)基因逆转录病毒的感染效率,并使其经受超速离心以达到进一步浓缩.方法应用GFP-RV质粒转染PT67细胞并用G418筛选出GFP阳性克隆,利用其产生的病毒上清液再转染GP2-293细胞,在G418筛选的同时,瞬时转染VSV-G基因.收集该GP2-293细胞产生的重组病毒作滴度测定,并通过低温超速离心制成含GFP病毒的浓缩液,再感染NIH3T3细胞,观察GFP在NIH3T3细胞内的表达情况.结果 GFP-RV质粒转染PT67细胞产生的GFP阳性克隆,随着细胞传代过程,GFP的表达逐渐减弱.GP2-293细胞转染VSV-G 基因后可产生(7.5±1.4)×l05cfu/mL的GFP重组假病毒,将其浓缩液转染NIH3T3细胞,可见GFP在细胞内有较强的表达.结论逆转录病毒与VSV-G共转染GP2-293包装细胞可以形成高滴度的假病毒,由此得到含GFP基因的病毒上清液,其在组织工程中应用范围更广泛.     

Y染色体ZFY基因检测在组织工程中的应用

目的 探讨人的Y染色体ZFY基因诊断在组织工程中的应用.方法 对两种人的组织工程皮肤"替代物"进行RT-PCR检测,从mRNA水平检测Y染色体ZFY基因表达.用三条引物同时扩增,Y染色体可产生两个片断,X染色体产生一个片断.结果 取男性细胞构建的表皮膜片修复女性皮肤缺损区的少量组织,可以检测到494bp和294bp两个条带;女性则494bp一个条带.检出率达100%(16/16).用男性包皮角质干细胞构建的复合皮肤修复雌鼠全层皮肤缺损,取植入处少量组织检测到人的Y染色体494bp和294bp两个条带,且维持创面修复时间长达8个月.结论 Y染色体ZFY基因诊断可作为组织工程皮肤替代物性别标记,且可以跟踪检测,具有特异、准确之优点.     

软骨细胞老化过程中胞外基质表达水平的改变

目的研究猪耳软骨细胞在体外培养传代过程中,细胞老化相关基因和胞外基质相关基因表达水平的改变。方法取体外培养猪耳软骨细胞,通过光镜,对各代细胞的形态学变化进行观测。RT-PCR检测各代细胞中bcl-2、端粒酶、Ⅰ型胶原和Ⅱ型胶原在mRNA表达水平上的改变。结果体外培养软骨细胞随着老化的进程,逐渐显现衰老和凋亡的特征。凋亡抑制基因bcl-2和控制细胞分裂的端粒酶的表达显著下降(P<0.01)。软骨细胞的特征性基质分子Ⅱ型胶原在第3代时表达水平有显著下降(P<0.01),降至原代细胞的5.47%±1.04%,在第4代几乎不再表达。而Ⅰ型胶原在第5代时,有显著上升(P<0.01);在第9代时又显著下降(P<0.01)。结论猪软骨细胞经体外培养,由第4代起逐渐发生去分化,丧失软骨细胞的表型。同时,细胞的增殖分裂能力亦逐步减退,细胞凋亡现象明显增加。     

应用GFP基因转染技术示踪组织工程技术构建角膜基质

目的 应用基因转染技术将绿色荧光蛋白(GFP)标记角膜基质绌胞，以此为种子细胞构建角膜基质并对构建过程进行示踪。方法 构建携带EGFP基因的重组逆转录病毒载体PLNCX2-EGFP，转染兔角膜基质细胞，然后将该细胞接种于PGA，形成细胞-生物材料复合物，移植于母兔角膜基质板层内。术后8周，组织学切片，HE染色，荧光显微镜下对绿色荧光蛋白(GFP)进行示踪观察。结果 8周后，组织工程化角膜组织形成，组织学切片显示PGA完全降解，新生组织形成，组织排列规整，荧光显微镜下见新生组织呈绿色，提示EGFP表达。结论 组织工程角膜基质的组织学结构与角膜基质相类似。新生组织表达GFP，证实组织工程角膜基质组织的构成源于供体细胞。     

基因转染技术提高体内构建组织工程化软骨质量的实验研究

目的:研究转化生长因子β1(TGF-β1)cDNA基因转染对软骨细胞Ⅱ型胶原表达的调控作用,为基因转染技术在软骨组织工程中的应用提供理论依据。方法:利用脂质体Fugene6将含TGF-β1基因的真核表达载体及空白载体分别转染至软骨细胞(基因转染组和对照组),RT-PCR、Northern-Blots、原位杂交及免疫组化检测TGF-β1调节体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原表达的变化。结果:TGF-β1基因转染软骨细胞后,其Ⅱ型前胶原mRNA及其蛋白的表达均显著增强,且随着TGF-β1蛋白表达的丧失,其对软骨细胞Ⅱ型前胶原mRNA表达的促进作用亦逐渐减弱。结论:TGF-β1可以上调体外培养软骨细胞Ⅱ型胶原的表达。     

TORCH与优生：Ⅱ．羊水细胞、绒毛、畸胎组织及宫颈分泌物等单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型的PCR检查

我室应用聚合酶链反应(PCR)技术，采用自行设计和合成的三条引物(一条为两型共同引物，两条为两型特异引物)蛆成一个反应扩增体系，对63例羊水或绒毛、14例畸胎组织、100例宫颈分泌物及50例宫颈石蜡包埋切片进行单纯疱疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型的检测，其阳性率分别为4．8%，14．3%，16%及10%。阳性标本中90%是HSV—Ⅱ，10％为HSVⅠ型或Ⅰ Ⅱ型混合感染。提示：HSV—Ⅱ感染与胎儿先天性畸形有关，与宫颈组织炎性浸润、细胞过度增生也有关系。     

增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染对人骨髓基质细胞体外成骨诱导的影响

目的 研究增强型绿色荧光蛋白(EGFP)转染人骨髓基质细胞(MSC)，对其体外诱导后表达成骨表型的影响，探讨EGFP作为骨组织工程种子细胞示踪剂的可行性。方法 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，并转染骨髓基质细胞，G418进行筛选。将转染后稳定表达绿色荧光蛋白的骨髓基质细胞(MSC-EGFP)进行成骨诱导扩增，以未转染的MSC为对照组，分别检测成骨诱导后碱性磷酸酶(AKP)活性，骨钙蛋白(OCN)含量和成骨细胞转录因子(Cbfal)的表达。结果 构建携带增强型绿色荧光蛋白(EGFP)重组逆转录病毒载体，转染后获得稳定表达绿色荧光蛋白的MSC-GFP，其体外经成骨诱导后，同样能表达成骨特征性表型，AKP，OCN，Cbfal表达和未转染组无明显差别。结论 MSC转染EGFP后，不影响其体外成骨诱导后成骨表型的表达，EGFP可作为骨组织工程种子细胞(MSC)良好的示踪剂。     

病毒介导的基因转染在组织工程中的应用

目的构建重组病毒载体,将较多细胞因子通过病毒载体转入种子细胞,提高细胞增殖及分泌基质能力,维持表型,延缓老化.方法应用基因工程技术,构建缺陷型逆转录病毒重组载体和缺陷性腺病毒重组载体.分别通过PT67包装细胞筛选克隆及293细胞扩增,获得假病毒上清液,经浓缩纯化后转染靶细胞.结果成功构建胶质细胞源性神经营养因子(GDNF)、Fas 配体(Fas-Ligand)、绿色荧光蛋白(GFP)等逆转录病毒载体以及TGFβ1、人骨形成蛋白因子-7(hBMP7)、端粒酶、Smad3、Smad7等腺病毒载体,其中GFP-逆转录病毒重组载体在软骨细胞表达至2月.结论通过有效的含目的基因重组载体转染种子细胞,延缓体外培养细胞的老化及促进细胞的增殖与基质分泌,获得组织工程所需要的大量种子细胞,为组织工程构建奠定了基础.     

含GFP基因的逆转录病毒与VSV-G蛋白重组形成高滴度假病毒

目的 通过与疱疹性口腔炎病毒糖蛋白G基因(VSV-G)蛋白重组,提高含绿色荧光蛋白(GFP)基因逆转录病毒的感染效率,并使其经受超速离心以达到进一步浓缩。方法 应用GFP-RV质粒转染PT67细胞并用G418筛选出GFP阳性克隆,利用其产生的病毒上清液再转染GP2-293细胞,在G418筛选的同时,瞬时转染VSV-G基因。收集该GP2-293细胞产生的重组病毒作滴度测定,并通过低温超速离心制成含GFP病毒的浓缩液,再感染NIH3T3细胞,观察GFP在NIH3T3细胞内的表达情况。结果 GFP-RV质粒转染PT67细胞产生的GFP阳性克隆,随着细胞传代过程,GFP的表达逐渐减弱。GP2-293细胞转染VSV-G基因后可产生(7.5±1.4)×105cfu/mL的GFP重组假病毒,将其浓缩液转染NIH3T3细胞,可见GFP在细胞内有较强的表达。结论逆转录病毒与VSV-G共转染GP2-293包装细胞可以形成高滴度的假病毒,由此得到含GFP基因的病毒上清液,其在组织工程中应用范围更广泛。     

FasL基因转染Hela细胞体外诱导淋巴细胞凋亡的作用

目的应用FasL基因转染具有上皮细胞特性的Hela细胞,探讨FasL基因的表达对诱导同种异体淋巴细胞凋亡的作用,为解决同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥问题提供一条研究途径.方法 PLNCX2-FasL质粒转化大肠杆菌,抽提纯化的PLNCX2-FasL质粒用限制性内切酶Xho I,Not I酶切,琼脂糖凝胶电泳得到755 bp大小的目的条带.紫外灯下切割回收目的条带并抽提纯化得到FasL基因,用Xho I,NotI酶切PCDNA3.1质粒载体并在相同位点插入FasL基因,T4酶连接,构建PCDNA3.1-FasL重组质粒.脂质体转染法将PCDNA3.1-FasL基因转染Hela细胞,G418筛选;经过免疫细胞化学法,RT-PCR鉴定后,进行单项淋巴细胞混合试验,检测FasL基因对诱导淋巴细胞凋亡的作用.结果表达FasL基因的Hela细胞的淋巴细胞刺激指数较对照组转染空白质粒的Hela细胞下调,仅达到对照组刺激指数的17.01%.结论 FasL基因转染上皮细胞可诱导淋巴细胞凋亡,为研究避免同种异体组织工程化皮肤的免疫排斥提供了一种可行的方法和设想.