尖锐湿疣患者外周血Vα24+天然杀伤T细胞数量与体外活化的研究

由于尖锐湿疣发病机制不清,目前尚无满意治疗方法。近几年研究发现,表达部分天然杀伤细胞受体和T细胞受体(TCR)Vα24⁺片段的天然杀伤T(NKT)细胞在抗病毒及免疫调节中都发挥着重要作用。     

ASCT2胞外域ECL2原核可溶性表达条件的优化及其纯化

目的 构建重组人ASCT2胞外域ECL2融合蛋白的原核表达载体,优化其在大肠埃希菌中可溶性表达的条件,并获得纯化的ECL2蛋白.方法 以PCR方法扩增编码ECL2的DNA片段,插入至pET-41b载体中,构建ECL2的原核表达载体,转化至大肠埃希菌,优化可溶性表达条件,GSH-Agarose亲和层析纯化并鉴定,与MCF-7细胞结合活性的测定.结果 免疫印迹显示,ECL2融合蛋白既表达于包涵体中,也能以可溶性形式表达.随IPTG浓度的增高,可溶性表达水平提高;培养温度为28 ℃和33 ℃时可溶性产物高于37 ℃;而随诱导时间的延长至12 h以上,可溶性表达量下降.可溶性表达优化条件为:温度33 ℃、IPTG浓度0.4 mmol/L、诱导时间4 h.经亲和层析获得高纯度ECL2蛋白并具有与MCF-7细胞结合活性.结论 优化了ECL2融合蛋白的可溶性表达条件,通过亲和层析一步法可获得高纯度融合蛋白.     

激光共聚焦显微镜在细胞内ROS研究中的激光干扰问题

目的 对激光共聚焦显微镜在细胞内ROS研究中的激光干扰问题进行探讨.方法 ROS探针标记ECV-304及BAW264.7细胞后,激光共聚焦显微镜488nm波长检测器分别进行连续和间隔观测1200s,比较两种观测方式下细胞荧光强度的变化;外源性加入H2O2,证实间隔观测时系统的灵敏性.结果 在连续观测方式下,细胞荧光强度短时间内显著增强,改为间隔观测后细胞荧光强度变化缓慢,但维持在低水平且在外源性加入H2O2后细胞荧光强度迅速增强.结论 激光共聚焦显微镜激发激光可引起细胞大量产生ROS,对检测系统造成干扰,采用间隔观测的方法可显著改善系统自身的这种缺陷,并能保持系统的检测灵敏性.     

HLA-A2+供者外周血hCMV特异性CTL的定量及其表型分析

目的:利用加载人巨细胞病毒(hCMV)结构蛋白pp65衍生抗原肽NLV(pp65495-503)的HLA-A0201(A2-NLV)四聚体,探讨四聚体染色条件的优化及其在特异性CTL表型分析中的应用。方法:取HLA-A2 供者外周血,以A2-NLV四聚体/PE在不同条件下染色,然后以anti-CD3-FITC和anti-CD8-APC标记,流式细胞术分析染色结果,寻找四聚体最佳染色条件,并分析特异性CTL的表型和活化抗原表达。结果:以全血样进行四聚体染色结果优于分离的PBMC。A2-NLV四聚体用量为0.3μg时,与100μL全血于4℃温育1h,特异性染色效果最佳,而与CD8-T细胞非特异性结合很低。以此优化条件进行特异性CTL表型分析,结果显示CD28阳性的A2-NLV四聚体特异性CTL的百分率较非特异性CTL低,表达CD57的百分率较非特异性CTL高,CD25分子只表达于活化的特异性CTL上。结论:通过对染色条件进行优化可明显提高四聚体染色的特异性,降低非特异性结合,优化的四聚体染色法能用于抗原特异性CTL的表型和功能分析。     

小檗碱对小鼠淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响

目的 :分析小檗碱 (Ber)对小鼠淋巴细胞体外增殖和细胞周期的影响 ,探讨其免疫抑制作用的机制。方法 :分离小鼠淋巴结细胞 ,以CFSE染色 ,加入多克隆刺激剂刀豆蛋白 (ConA)或者佛波醇酯 (PDB)和离子霉素 (Ion)进行刺激 ,以流式细胞仪分析小檗碱对淋巴细胞增殖率的影响 ;以WST 1检测淋巴细胞的增殖情况 ;用碘化丙锭 (PI)染色分析细胞周期分布 ;细胞凋亡以Annexin V染色进行分析。结果 :CFSE染色分析显示 ,当浓度为 10 0、30和 10 μmol L时 ,Ber无论对ConA或PDB Ion诱导的小鼠淋巴细胞增殖 ,都具有明显的抑制作用 (P <0 0 5 )。以WST 1分析细胞增殖情况 ,也获得相似的结果。对细胞周期分析表明 ,随着小檗碱浓度的增加 ,处于亚二倍体峰的细胞数增加 ,处于S和G2 M期的细胞数则减少 ,而G0 G1 期的细胞数基本不变。Annexin V染色法结果表明 ,30 μmol LBer组Annexin V单阳性区域的百分率为 ( 7 13± 1 0 8) % ,与PDB Ion阴性组的百分率 ( 2 4 9± 0 2 5 ) %比较有显著的差异 (P <0 0 1)。结论 :小檗碱对小鼠淋巴细胞的增殖有明显抑制作用 ,它能抑制淋巴细胞进入细胞分裂周期 ,这种抑制作用表现出明显的周期特异性。同时 ,Ber可以诱导体外培养的小鼠淋巴细胞发生凋亡。     

小檗碱对DNFB诱导的小鼠迟发型超敏反应的影响

目的:研究小檗碱(Ber)对二硝基氟苯(DNFB)诱导的小鼠迟发型超敏反应(DTH)的影响,探讨其免疫抑制作用的机制。方法:BALB/c小鼠分为对照组、DTH组与Ber处理的DTH组。对照组以不含DNFB的溶剂处理,DTH组以5g/LDNFB腹部致敏、耳廓激发的方法建立模型,Ber处理的DTH组每天腹腔注射(i.p)Ber,连续7d,总剂量为30mg/kg体质量。激发后48h,取小鼠双耳称重了解Ber对炎症抑制率的影响。镜下观察耳廓局部组织的变化;以结晶紫法检查Ber对脾脏T淋巴细胞与细胞外基质(ECM)黏附作用的影响;以膜联蛋白V(AnnexinV)染色检查淋巴结细胞的凋亡率。结果:双耳称重的结果显示,Ber处理的DTH组与DTH组具有显著的差异(P<0.05),能明显抑制DNFB引起的炎症反应;耳廓局部组织学检测也表明,Ber能够抑制DNFB诱导的DTH,明显减少淋巴细胞的浸润。Ber处理的DTH组的T细胞与ECM的黏附能力明显降低(P<0.05)。Ber处理的DTH组与DTH组和对照组的细胞凋亡率均无明显差异(P>0.05)。结论:Ber对DNFB诱导的小鼠DTH具有明显的抑制作用,降低小鼠T细胞与ECM的黏附能力可能是其抑制DTH的机制之一。     

人EGF受体胞外域在大肠杆菌中表达、复性及抗原性鉴定

目的 构建人EGF受体（EGFR）胞外域的原核表达载体并在大肠杆菌中表达,制备EGFR特异性抗体,对表达产物进行鉴定。方法 以PCR方法从克隆的EGFR胞外区cDNA中扩增编码胞外结构域L1、S1、L2（EGFR-LSL）的DNA片段,并在其3′端加入编码His6标签的序列,与pET-3c连接构建EGFR-LSL原核表达载体,在大肠杆菌中进行表达;同时以纯化的EGFRL2结构域蛋白（EGFR-L2）制备抗血清,以此抗血清鉴定表达产物。结果 EGFR-LSL在大肠杆菌BL21（DE3）中获得高效表达,抗His6抗体免疫印迹分析表明,表达产物全部以包涵体形式存在,通过Ni2^＋．NTA柱上复性获得纯化的可溶性EGFR-LSL蛋白;免疫印迹分析表明,EGFR-LSL与小鼠抗EGFR-L2抗血清具有高特异性反应。结论 从大肠杆菌中获得具有特异抗原性的可溶性EGFR-LSL蛋白。