麦胚凝集素诱导小鼠成纤维细胞L929发生凋亡的研究

目的:研究麦胚凝集素(WGA)是否能够诱导小鼠成纤维细胞L929发生凋亡及其可能的分子机制。方法:分别收集以WGA或琥珀酰化WGA(sWGA)处理24 h的L929细胞,经碘化丙啶染色后,以流式细胞仪分析细胞凋亡百分率,同时以荧光显微镜观察吖啶橙染色细胞的形态。结果:WGA处理过的细胞,其DNA亚二倍体峰 (Sub-G₁) 即凋亡峰的百分率明显升高,且与WGA剂量呈正相关;而sWGA处理的细胞则无此现象。同时,荧光显微镜观察发现WGA处理的细胞发生核碎裂,但sWGA无此作用。结论: WGA能诱导L929细胞发生凋亡,而sWGA不能诱导该细胞凋亡,提示WGA结合至细胞表面唾液酸残基是其诱导凋亡所必需;WGA诱导细胞凋亡的能力可部分解释其细胞毒性。     

胡椒碱与棉酚联用对前列腺癌DU145细胞生长抑制的协同作用

目的研究胡椒碱与棉酚联合用药对激素非依赖型前列腺癌DU145细胞生长的抑制作用及其机制。方法 MTS比色法检测细胞活性;流式细胞术分析细胞周期;免疫印迹法检测细胞周期相关蛋白以及CYP3A4的表达。结果胡椒碱本身的细胞毒性较小,但与棉酚联用时,表现出协同作用。棉酚对细胞的半数抑制浓度IC50由单用时的21.00μmol·L-1下降到联合用药时的8.07μmol·L-1;两药相互作用指数CDI<1。胡椒碱与棉酚联合用药,可引起细胞G0/G1期阻滞和亚二倍体峰(凋亡峰)增加;同时上调细胞周期抑制蛋白p21Cip1的表达,并下调Cyclin D1、Cyclin A、CyclinB1以及药物代谢酶CYP3A4的表达。结论胡椒碱与棉酚联用,可能是通过诱导细胞周期阻滞,增强凋亡以及抑制CYP3A4药物代谢酶活性,发挥其协同抗前列腺癌作用。     

负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽HLA-A*2402四聚体制备及鉴定

目的:构建负载人恶性黑素瘤相关抗原gp100抗原肽的HLA-A*2402四聚体并进行鉴定,为分析gp100抗原肽诱发的特异性细胞免疫应答创造条件。方法:以羧基端融合生物素化酶BirA底物肽的HLA-A*2402重链胞外域融合蛋白、人β2-微球蛋白、gp100 VYFFLPDHL抗原肽、PE-链亲和素为材料,制备HLA-A*2402/VYF四聚体;非还原SDS-PAGE鉴定四聚体四聚化程度;三色免疫荧光标记流式细胞术分析HLA-A*2402+健康志愿者外周血gp100特异性CD8+T细胞的频率。结果:HLA-A*2402/VYF四聚体形成率为83%,所制备的四聚体具有与HLA-A*2402+供者抗原特异性CD8+T细胞的结合活性,特异性CD8+T细胞的频率为外周血总CD8+T细胞的0.02%～0.06%。结论:成功制备HLA-A*2402/VYF四聚体并用于检测gp100特异性CD8+T细胞,为研究HLA-A*2402+黑素瘤患者免疫治疗的机制及疗效监测创造了条件。     

环孢菌素A对小鼠T细胞活化影响的血清免疫药理学评价

目的　应用血清免疫药理学技术 ,探讨环孢菌素A(CsA)对T细胞体外活化的影响 ,以进一步揭示CsA免疫调节的分子机制 ,为临床用药提供理论依据。方法　分离小鼠淋巴结细胞 ,分别与CsA、5 %CsA血清预孵后 ,加入多克隆刺激剂继续培养共 2 4h。收获细胞 ,进行双色免疫荧光标记 ,以流式细胞术分析T细胞上CD6 9分子的表达情况。结果　在CsA和 5 %CsA血清作用下 ,ConA活化的T细胞CD6 9表达的百分率分别为 (2 4 15± 3 38) %和 (2 3 6 8±6 89) % ,与相应对照组 [分别为 (6 4 6 7± 5 88) %和 (6 4 35± 10 13) % ]相比较均有显著差异 (P <0 0 1) ;在CsA和5 %CsA血清作用下 ,PDB活化的T细胞CD6 9表达的百分率分别为 (78 86± 7 70 ) %和 (80 0 5± 9 91) % ,与相应对照组 [分别为 (84 79± 6 87) %和 (79 6 8± 4 17) % ]相比较均无显著差异 (P >0 0 5 )。结论　CsA(410nmol/L)和含CsA血清均可强烈抑制ConA刺激的T细胞活化 ,而对PDB刺激的T细胞活化无抑制效应。 5 %CsA血清与CsA单纯药物体外实验的结果相一致 ,在一定程度上反映了临床等效剂量下血清免疫药理技术的有效性与可行性     

增强型绿色荧光蛋白在人软骨细胞中的表达及修复重建人软骨示踪方法的研究

目的：检测增强型绿色荧光蛋白(enhanced green fluorescence protein，EGFP)基因在原代培养的人鼻中隔软骨细胞的转染效率及瞬时表达，建立原代培养的人鼻中隔软骨细胞的示踪方法，为用组织工程法修复重建人软骨寻求示踪方法提供依据。方法：在大肠杆菌中扩增pEGFP-N1质粒，通过Amaxa细胞核转染仪将pEGFP-N1质粒转入原代培养的人鼻中隔软骨细胞，应用荧光显微镜和激光共聚焦显微镜观察其转染过程及瞬时表达情况，流式细胞仪检测其转染效率。结果：增强型绿色荧光蛋白在基因转染24h后得到了明显表达，48h后流式细胞仪检测其转化率为35．37％，且未影响软骨细胞的贴壁过程。结论：经pEGFP-N1质粒转染的原代培养的人软骨细胞仍能在体外存活，pEGFP-N1是转染原代培养的人软骨细胞较为理想的瞬时表达载体．也是组织工程化软骨形成过程的良好示踪剂。     

联合应用活体染料CFDA-SE和SNARF-1检测混合淋巴细胞反应

目的：建立一种能够对单向混合淋巴细胞反应中应答细胞的应答强度进行更全面评价的增殖检测方法.方法：BALB/cJ小鼠淋巴结细胞经CFDA-SE标记后作为应答细胞,BALB/cJ或C57BL/6小鼠脾细胞经丝裂霉素C处理后再用SNARF-1标记,作为刺激细胞,进行混合培养.混合培养96 h后收获细胞,用流式细胞术进行检测,分析SNARF-1-CFSE＋应答细胞的增殖情况,并用ModFit^TM软件拟和以获得更多增殖相关指数.结果：随着应答细胞分裂代数的增加,CFSE荧光强度逐渐减弱直至与刺激细胞无法分开,通过划除SNARF-1阳性细胞以确定应答细胞,解决了这一问题.应用ModFit^TM软件,获得应答细胞的前体频率和增殖指数等多项重要的增殖相关指标.结论：联合应用CFSE和SNARF-1染色,结合流式细胞术,可作为评价混合淋巴细胞反应中应答细胞的应答强度的有力工具.     

小檗碱联用环孢素诱导免疫耐受后对肾功能的影响

目的　研究小檗碱联用环孢素诱导同种异基因移植免疫耐受后对受体肾功能的影响。方法　采用Ono’s方法建立同种异基因大鼠心脏异位移植免疫耐受模型 ,将实验动物分为 5组。对照组 (Wistar Wistar) :每天注射生理盐水共2 1d ;安慰剂组 (SD Wistar) :每天注射生理盐水共 2 1d ;CsA组 (SD Wistar) :每天按 2mg·kg-1剂量注射环孢素A(Cy closporineA ,CsA)共 2 1d ;Ber组 (SD Wistar)每天按 16mg·kg-1剂量灌服小檗碱 (Berberine,Ber)共 2 1d ;CsA +Ber组(SD Wistar) :每天按 2mg·kg-1剂量注射CsA ,16mg·kg-1剂量灌服Ber共 2 1d ,观察受体血清尿素氮 (BUN)、肌酐(Cr)指标水平的变化。结果　联用Ber后 ,降低了受体长时间使用CsA后的尿素氮 (BUN)和肌酐 (Cr)水平。结论　联用Ber有助于减轻长期使用CsA后对受体肾功能的影响     

三七提取物对小鼠淋巴细胞活化、增殖和腹腔巨噬细胞产生NO的影响

目的 分析三七提取物（SE）对小鼠淋巴细胞体外活化、增殖以及对巨噬细胞产生NO的影响，探讨其免疫抑制作用的机制。方法 以多克隆刺激剂刀豆蛋白A（ConA）刺激淋巴细胞活化和增殖，利用荧光标记的单克隆抗体双染技术和流式细胞术检测SE对小鼠CD3^＋T细胞CD69表达的影响；通过CFSE染色流式细胞术检测SE对淋巴细胞增殖的影响；用脂多糖（LPS）或淋巴细胞培养上清液（lymphocytes culture supernate，LCS）体外诱导小鼠腹腔巨噬细胞分泌NO，采用Griess试剂盒检测NO的水平。结果 在ConA刺激6h后小鼠T细胞活化率为59．79％，50、100μg／ml的SE可显著降低其活化率，分别为46．50％和37．73％（P〈0．01）。在培养72h后，不同浓度SE能明显抑制ConA诱导T细胞的增殖。SE在12．5～100μg／ml的浓度范围内对淋巴细胞培养上清和LPS诱导小鼠腹腔巨噬细胞NO的释放具有抑制作用（P〈0．01）。结论 三七提取物对小鼠淋巴细胞的活化、增殖有明显抑制作用，并能抑制巨噬细胞产生NO（P〈0．01）。     

蛋白激酶C抑制剂对T细胞表达IL-2及IFN-γ的影响

目的:研究蛋白激酶C(PKC)抑制剂H7和棉酚对体外活化T细胞表达白细胞介素-2(IL-2)和γ-干扰素(INF-γ)的影响。方法:在莫能菌素(monensin)存在时,以佛波醇酯(PDB)+离子霉素(I)体外活化人外周血单个核细胞(PBMC),以流式细胞术胞内细胞因子检测法分析H7和棉酚对CD3⁺T细胞表达IL-2和IFN-γ水平的影响。结果:PDB+I处理PBMC4h后,表达IL-2和IFN-γ的CD3⁺T细胞百分率分别为16.64±2.04和25.81±3.53(x±s),而对照组二者的比率为1.06±0.22及3.12±0.77(P＜0.05)。棉酚(50μmol/L)可明显抑制IL-2及IFN-γ的表达,抑制后表达率分别为2.08±0.12及9.01±1.90。H7作用比棉酚强,50μmol/L的H7抑制后的IL-2及IFN-γ阳性T细胞比率分别为0.43±0.06和2.40±0.27。结论:PKC在CD3⁺T细胞表达IL-2及IFN-γ中发挥重要作用;PKC抑制剂H7及棉酚明显抑制IL-2及IFN-γ的表达,提示H7和棉酚可通过抑制PKC活性,对依赖于T细胞功能的特异性免疫应答有调节作用。     

CTLA4-EGFP融合蛋白在K562细胞中的表达及其亚细胞定位研究

目的 :构建增强型绿色荧光蛋白 (EGFP)与CTLA4融合蛋白真核表达载体 ,分析其在K562细胞中的表达和亚细胞定位。方法 :以RT PCR方法克隆人CTLA4基因 ,构建CTLA4 EGFP融合蛋白的表达载体。以其转染K562细胞后 ,以流式细胞仪和激光共聚焦显微镜分析融合蛋白的表达及其亚细胞定位。结果 :从人外周血细胞中克隆到CTLA4基因的cDNA。通过PCR方法在起始位点前加入Kozak序列并删除终止密码 ,成功地构建CTLA4 EGFP融合蛋白表达载体。以该质粒转染K562细胞 2 4h后 ,CTLA4和EGFP双阳性细胞的百分率为 16%。表达的融合蛋白主要分布于胞内 ,细胞膜上分布较少。相反 ,转染空载体的细胞仅表达EGFP ,且其在细胞内呈弥散样分布。以佛波醇酯加离子霉素刺激后 ,CTLA4 EGFP融合蛋白在细胞表面表达水平升高到 2 9% ,且分布于胞内的融合蛋白向细胞膜靠近并与质膜融合 ;而转染空载体的细胞内EGFP的分布无明显改变。结论 :成功地构建CTLA4 EGFP融合蛋白表达载体 ,并在K562细胞中得到表达。表达的融合蛋白与天然CTLA4在活化T细胞中的定位和转运特点相似