粒细胞集落刺激因子动员对大鼠内皮祖细胞体外扩增的影响

背景：内皮祖细胞在缺血性疾病治疗应用中存在数量低的问题，许多细胞因子影响其动员效果和功能。 目的：观察粒细胞集落刺激因子动员对体外扩增骨髓源性内皮祖细胞数量及功能的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-08/2008-03在北京大学人民医院肝病研究所完成。 材料：SPF级健康成年SD雄性大鼠16只，随机分为动员组和对照组，8只/组。重组人粒细胞集落刺激因子为麒麟鲲鹏生物药业有限公司产品。 方法：实验前动员组大鼠皮下注射经生理盐水稀释的重组人粒细胞集落刺激因子10μg/kg，2次/d，共5 d。采用密度梯度离心法分别从两组大鼠骨髓获取单个核细胞，洗涤后按2×107/孔接种在包被大鼠纤连蛋白的6孔板上，采用贴壁法纯化得到内皮祖细胞。 主要观察指标：骨髓单个核细胞集落数及细胞表型，骨髓源性内皮祖细胞贴壁情况及细胞表型，通过DiI-acLDL摄取、体外血管生成进行内皮祖细胞功能学鉴定，透射电镜观察细胞超微结构。 结果：与对照组比较，动员组骨髓单个核细胞集落增多，CD45+/CD34+、CD133+和Flk-1+阳性率均明显升高（F=5.655~61.892，P < 0.05）。培养第7，9天与对照组比较，动员组骨髓源性内皮祖细胞贴壁数、CD45+/CD34+、CD133+和Flk-1+阳性率均明显升高（F=5.694~38.879，P < 0.05）。贴壁细胞F1TC-UEA-1/Dil-acLDL双荧光染色阳性率为90%，接种于Matrigel包被的培养板24 h后形成毛细血管索样结构，胞质内有Weibel-Palade小体存在。 结论：粒细胞集落刺激因子动员能增加骨髓源性内皮祖细胞的数量，并促进其分化、增殖功能。     

大鼠内皮祖细胞的培养及鉴定

目的 探索大鼠内皮祖细胞的分离培养,为缺血性疾病细胞移植治疗提供实验方法.方法 采集大鼠骨髓,梯度密度离心法分离单核细胞,内皮细胞培养液M199培养基培养(含20%FCS+15 ng/ml VEGF),种植于提前包埋了纤维连接蛋白的六孔板培养,应用免疫荧光和流式细胞技术鉴定内皮细胞系列标志:CD34、CD31、Flk-1和祖细胞标志CD133.并通过检测其对FITC标记的UED-1的吸附和内吞DiI-acLDL来进行细胞功能学的鉴定.结果 经过梯度密度离心和贴壁法选择的细胞表达内皮细胞特异性抗原CD34、CD31、Flk-1,部分表达CD133.大鼠骨髓单个核细胞经体外诱导分化,培养第5～14天的贴壁细胞不同程度的表达CD34、CD133、Flk-1和CD31.培养第9天流式细胞仪检测其阳性率分别为(40.12±6.28)%、(15.62±4.31)%、(44.05±8.20)%和(76.1±7.20)%,细胞能特异性吸附FITC标记的荆豆凝集素并内吞DiI-acLDL,并且在Matrigel上可以形成毛细血管样.结论 大鼠骨髓可以分离培养内皮祖细胞并能体外扩增,为内皮祖细胞的移植研究奠定了基础.     

思美泰联合茵栀黄治疗淤胆型肝炎21例

目的:观察思美泰联合茵栀黄治疗淤胆型肝炎的疗效.方法:在保肝、降酶等对症治疗的基础上,治疗组用思美泰注射液1000mg 5%GS 500ml静滴,1次/d,2w后改口服思美泰500mg,2次/d,茵栀黄注射液40ml 5%GS 500ml静滴,1次/d,疗程1个月.结果:治疗组明显优于对照组,P<0.01.结论:思美泰联合茵栀黄治疗淤胆型肝炎有一定疗效.     

NY-ESO-1和MAGE-A3抗原肽诱导肝癌患者的免疫应答研究

目的利用合成的HLA-A02限制性NY—ESO-1 p157—165或MAGE—A3p271—279抗原肽,体外通过抗原递呈细胞诱导HCC患者外周血T淋巴细胞,从而成功诱导出特异性CD8^＋T淋巴细胞免疫应答。方法通过SSP方法筛选20例HLA—A＊02的HCC患者的HLA亚型;通过逆转录多聚酶链反应和测序分析NY—ESO-1和MAGE—A3在肝癌组织中的表达以及多肽表位密集区的核苷酸变异状况;体外用细胞因子培养HCC患者外周血来源的树突状细胞（DC）;人工合成HLA—A＊02限制性NY—ESO-1p157—165或MAGE—A3 p271—279多肽,直接或用去除CD8^＋T淋巴细胞的PBMC或DC递呈,体外同T淋巴细胞孵育16d后,利用Elispot、细胞内细胞因子染色和四聚体实验检测T细胞免疫应答。结果20例HLA—A＊02患者中,NY-ESO-1mRNA阳性患者为11例,MAGE—A3mRNA阳性患者12例。中国HCC患者表达的NY—ESO-1和MAGE—A3序列高度保守。经多肽直接或用去除CD8^＋T淋巴细胞的PBMC或DC递呈,体外活化外周血T淋巴细胞,4例（36．4％）NY—ESO-1阳性HCC患者以及4例（33．3％）MAGE．A3患者产生针对多肽特异性的CD8’T细胞免疫应答。不同HLA—A＊02亚型HCC患者可产生针对NY—ESO-1p157—165或MAGE—A3p271—279抗原肽的免疫应答。结论NY—ESO-1p157-165或MAGE—A3p271—279抗原肽可以诱导出针对抗原肽的特异性CD8^＋T淋巴细胞免疫应答。提示HLA—A＊02限制性的NY-ESO-1 p157-165或MAGE—A3p271—279抗原肽可以作为有潜力的肝癌免疫治疗疫苗。     

内皮祖细胞移植对大鼠肝硬化作用的研究

目的 探讨内皮祖细胞(endothelial progenitor cells,EPCs)移植对四氯化碳(carbon tetrachloride,CCl4)诱导的大鼠肝硬化的作用.方法 本组38只SD大鼠中8只大鼠为正常对照,其余30只采用25%的CCl4/橄榄油灌胃制备肝硬化模型.再将肝硬化大鼠分为3组,每组10只.12周后直接处死的为肝硬化模型组,门静脉输入大鼠EPCs为EPCs移植组,经门脉输入生理盐水为移植对照组.移植4周后检测移植组和移植对照组大鼠肝组织胶原Ⅲ(collagen Ⅲ,COL Ⅲ)、平滑肌动蛋白(smooth muscle actin α,α-SMA)和Ki67的表达,检测外周血肝功能和血凝分析.结果 肝硬化模型组大鼠肝脏体积增至正常时的2倍.EPCs移植组大鼠与肝硬化模型组比较,肝组织学活动指数(histological activity index,HAI)(F=75.062,P<0.01),丙氨酸氨基转移酶(alanine aminotransferase,ALT)(F=29.942,P<0.05),门冬氨酸氨基转移酶(aspartate aminotransferase,AST)(F=16.618,P<0.05)和总胆红素(total bilirubin,TBIL)(F=9.911,P<0.05)水平降低,白蛋白(albumin,Alb)(F=4.944,P<0.05)和Ki67(F=45.966,P<0.01)水平升高,纤维化面积(F=25.025,P<0.05)减少,α-SMA(F=7.86,P<0.05)和COL Ⅲ(F=135.787,P<0.01)表达降低;与正常肝脏相比,移植对照组HAI,ALT,AST和TBIL水平升高,Alb和Ki67水平降低,纤维化面积增加,α-SMA和COL Ⅲ表达升高(P<0.05).移植对照组大鼠凝血酶原时间延长,差异有统计学意义(P<0.05). 结论移植EPCs可以促进大鼠肝硬化的肝细胞增生,减轻肝纤维化程度.     

我国丁型肝炎病毒分子生物学和血清流行病学研究

丁型肝炎病毒(HDV)感染呈全球分布,特别是在南美的一些地区,曾发生HDV的暴发流行,我国是乙型肝炎病毒感染高发区,人群中HBV感染率达58.4％。为了解我国HDV感染状况,研究我国HDV基因组特征以及在我国是否存在HDV亚型,1988年我们承担了国家     

免疫抑制住院患者流感病毒感染的临床特征及抗病毒治疗分析

目的分析免疫抑制住院患者流感病毒感染的临床特征及抗病毒药物治疗情况。方法回顾性分析2015年11月至2022年3月北京大学人民医院甲型或乙型流感病毒核酸阳性的273例住院患者的临床资料, 其中123例为免疫抑制患者, 150例为非免疫抑制患者。分析免疫抑制流感患者的临床特征及抗病毒治疗情况。应用SPSS 22.0软件对数据进行统计学分析。结果免疫抑制患者中, 主要免疫抑制类型为恶性肿瘤化疗(61.8%, 76/123)和造血干细胞移植(24.4%, 30/123)。主要临床表现是发热(93.5%, 115/123)和咳嗽(41.5%, 51/123)。22.8%(28/123)患者合并其他感染, 43.9%(54/123)患者合并并发症。与非免疫抑制流感患者相比, 免疫抑制流感患者合并感染及并发症比例更高(χ2=9.365和7.496, P<0.01)。免疫抑制流感患者抗病毒药物联合应用较单药应用未缩短热退时间、病毒转阴时间、住院时间及减少死亡(U/χ2=312.5、356.0、749.5和0.185, P值均>0.05)。与未应用激素患者比较, 免疫抑制流感患者应用激素未...     

2a/Ⅲ型丙型肝炎病毒基因组非结构4区全长序列的扩增、克隆及分析

目的 获得2a／Ⅲ型丙型肝炎病毒（HCV）基因组全长非结构（NS）4区克隆并作序列分析。方法 用限制性长段长度多态性分析（RFLP）基因分型方法筛选出2a／Ⅲ型HCV一株。为了获得该毒株全长NS4区基因序列，依据代表株序列的NS3区之′末端及NS5区之5′末端相对保守区域合成引物，以RT－nseted-PCR方法扩增一段1.3kb的片段cDNA；将此片段插入pUC19质粒载体。结果 克隆了丙型肝炎基因组非结构NS4区全长基因，构建了pUC-NS4重组体，对重组体进行酶切鉴定，克隆的cDNA与预计的片段大小相符，并作序列测定。结论 获得全长NS4区基因克隆，经序列分析表明，与日本HC－J6有较高的同源性（92.1%）。     

用流式细胞仪富集大鼠骨髓干细胞

目的：建立大鼠骨髓干细胞富集的方法。方法：用常规方法从大鼠胫骨中获取骨髓细胞，采用红细胞裂解液去除红细胞，然后以PE标记的CD3、CD45RA抗体及FITC标记的Thy抗体标记细胞，最后通过流式细胞仪检测并分选Thy CD3^- CD45RA^ 细胞。结果：①大鼠骨髓细胞中CD3^ 、CD45RA^ 和Thy^ 细胞分别约占14．1％、4．2％和20．8％；②流式细胞仪分选的Thy^ CD3^-CD45RA^-细胞约占2．8％。结论：应用红细胞裂解液去除红细胞及通过流式细胞仪分离Thy^ CD3^-CD45RA^-细胞是一种较有效的富集大鼠骨髓干细胞的方法。