INNO-LiPA乙型肝炎病毒基因分型方法的评价

目的　评价INNO LiPA乙型肝炎病毒基因分型的方法 ,并探讨了基因型与临床疾病的关系。方法　随机选取 113例慢性HBV感染者外周血采用INNO LiPA和S基因序列分析两种方法测定HBV基因型。结果　 1 INNO LiPA基因分型法与S基因序列分析法测定的基因型结果比较 ,符合率 82 3% (93/ 113) ,误判率 3 5 % (4/ 113) ,B/C型混合感染检出率 5 3% (6 / 113)。 2 LC组和HCC组C基因型比率高于AsC组 ,差异有显著性 (分别为 92 9%比 5 2 8% ,X2 =7 0 3,P <0 0 1和 88 9%比 5 2 8% ,X2 =3 91,P <0 0 5 ) ;LC组C基因型比率高于CHB组 ,差异有显著性 (92 9%比 6 1 1% ,X2 =5 12 ,P <0 0 5 )。结论　 1 INNO LiPA法是一种较灵敏的快速检测HBV基因型的实验方法 ,尤其检测混合基因型感染灵敏度高。 2 C基因型HBV感染与较重肝病有关。     

中国南北两城市乙型肝炎病毒基因型与血清型的构成差异

目的对我国南北两城市530份乙型肝炎(乙肝)病毒(HBV)进行血清型和基因型分型,以了解HBV基因型和血清型分布的特点和差异。方法 对黑龙江省哈尔滨市和广东省廉江市530份乙肝病毒表面抗原(HBsAg)阳性血清进行HBV DNA基因扩增,并对扩增产物直接测序,分析HBV血清亚型和基因型。结果 哈尔滨和廉江市HBV血清型以adrq为最多,分别为87.2％和73.5％,其次为adw2,分别为12.0％和25.7％,其分布差异有非常显著意义(P<0.001);两市HBV基因型均以C型为主,分别为87.8％,73.2％,其次为B型,分别为12.2％和26.1％,其分布差异有非常显著意义(P<0.001),在廉江市仅有1例D型,1例B、C混合型。结论我国南北两城市HBV血清亚型和基因型的构成较为单纯,均只有两个类型,其比例构成差异有非常显著意义。     

两种黑色素瘤抗原基因在肝细胞癌中的表达

目的 检测黑色素瘤抗原MAGE-4和MAGE-10mRNA在中国人肝细胞癌（HC）中的表达,为用这两种基因编码蛋白作为疫苗对HCC患者进行免疫治疗提供依据。方法 用RT-PCR方法对48例HCC患者癌组织和相应癌旁肝组织、10例肝硬化组织和10例正常肝组织的MAGE-4和MAGE-10mRNA表达情况进行研究,并对RT-PCR扩增产物中目的基因片段进行cDNA序列测定。结果 48例HCC患者中,有15例（31.3%）表达MAGE-4,14例（29.2%)表达MAGE-10mRNA;而相应癌旁肝组织;腩硬化和正常肝组织均不表达,cDNA测序进一步证明,PCR产物中的目的基因片段为MAGE-4和MAGE-10cDNA序列,两种MAGE基因的表达与肿瘤大小。甲胎蛋白（α-FP）水平等临床指标无相关关系。结论 MAGE-4和MAGE-10在HCC组织中呈特异性的表达,面在癌旁非瘤性肝组织中均不表达,这使得以此抗原用于HCC患者的免疫治疗成为可能。     

肿瘤特异性肿瘤/睾丸抗原在肝癌组织中的表达

目的 研究7种主要肿瘤/睾丸(CT)抗原MAGE-1、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-10、NY-ESO-1、SSX-2、SCP-1在原发性肝细胞癌(HCC)患者癌组织中的表达、编码基因的变异状况及与临床指标的关系。 方法 收集30例肝癌患者的癌和癌旁组织,采用特异性引物逆转录聚合酶链反应检测7种CT抗原的表达,并对PCR产物进行测序分析。结果 在30例HCC患者中,MAGE-1、MAGE-3、MAGE-4、MAGE-10、NY-ESO-1、SSX-2、SCP-1在癌组织中的表达率分别为66.7％、70.0％、20.0％、36.7％、40.0％、33.3％和33.3％,而癌旁没有表达。癌组织中至少表达1种、2种和3种CT抗原的阳性率分别为90.0％、70.0％和53.5％。我国肝癌表达的7种CT抗原编码基因与国外报道的相比,同源性非常高。MAGE-10和SCP-1的表达与甲胎蛋白的水平相关,MAGE-3和SSX-2表达与平均年龄相关。 结论 7种CT抗原在HCC患者癌组织中均有表达,阳性率为20.0％-70.0％,其编码基因序列高度保守。一些CT抗原的表达与临床指标存在相关性。     

乙型肝炎病毒rtA181V/T和rtN236T变异阿德福韦耐药株表达质粒的构建及其病毒学特征

目的构建乙型肝炎病毒阿德福韦耐药变异株（rtA181T／V和rtN236T）表达载体并对其体外复制能力和耐药性等病毒学特征进行体外研究。方法以含1．2倍拷贝HBV DNA全基因的质粒PUC-HBV1．2WT为模板，PCR定点诱变技术构建含阿德福韦耐药株（rtA181V／T和rtN236T）的目的质粒，测序验证并利用变异株特异检测引物进行PCR检测；转染人肝癌细胞系HepG2，ELISA检测上清中分泌的HBsAg和HBeAg水平，荧光定量PCR检测上清中病毒DNA水平，Southern blotting检测胞浆HBV复制中间体水平，比较野生株和变异株体外复制能力和对阿德福韦敏感性的差异。结果构建的rtA181T、rtA181V和rtN236T表达质粒可用于变异株特异检测引物检测相应变异的阳性对照品；转染HepG2细胞后均可获得高水平的病毒抗原表达，胞浆和细胞培养上清中可以检测到HBV复制中间体和病毒颗粒的存在；三种变异均可单独导致对阿德福韦耐药，IC50为野生株的2．8至4．7倍；体外复制能力较野生株降低，分别为野生株的94．2％、89．0％和77．7％。结论成功构建乙型肝炎病毒阿德福韦变异株表达质粒并应用于变异株特异引物扩增检测技术，体外实验证实rtA181V／T和rtN236T单独变异均可导致HBV对阿德福韦耐药，且变异株的病毒复制能力较野生株有所下降。     

简便HBV基因型S基因PCR-RFLP分型方法的建立

目的 建立简便HBV基因型S基因PCR-限制性片段长度多态性(RFLP)分型方法(以下简称“简便PCR-RFLP法”),并评价其临床应用价值.方法 临床诊断研究.查阅并比较GenBank中128株HBV(基因型A～D型)S基因片段(S区nt253-687),设计限制性内切酶Hinf Ⅰ、Ear Ⅰ、Apo Ⅰ鉴别A～D基因型分型方法,并评价简便PCR-RFLP法检测HBV DNA的最低检测下限、重复性;然后,用该方法检测50例慢性乙型重型肝炎患者的HBV基因型,同时用直接测序法验证简便PCR-RFLP法检测HBV基因型的一致性.结果 建立了简便PCR-RFLP法HBV基因分型的方案,通过限制性内切酶Hinf Ⅰ一次酶切就可分出我国流行的B型、C型、D型等毒株及B/C混合型.随机抽取3份标本,不同稀释浓度下,用简便PCR-RFLP法重复检测HBV基因型,分型结果均与原血清完全一致,且最低检测下限约为7 ～9 IU/ml.经Hinf Ⅰ酶一步酶切后,用简便PCR-RFLP法从50例患者标本中,检出B型23份、C型10份;经直接测序法验证,从PCR产物中检出B型23份、C型10份,2种方法检测B、C型基因结果完全一致(Kappa=1.00,P=0.001),简便PCR-RFLP法检出B/C混合型9份,优于PCR产物直接测序法(0份,x2=18.00,P=0.001).Hinf Ⅰ酶一步酶切后分出的ABD型8份,进一步酶切及应用PCR产物直接测序法检测均为B型变异株.结论 建立的简便PCR-RFLP法对HBV基因分型有较高的灵敏度和重复性,且在检出混合基因型方面具有优势,更为简便.     

PKH26荧光标记大鼠内皮祖细胞在慢性损伤肝内迁移示踪

背景：课题组早期研究发现门静脉回输内皮祖细胞可以改善肝纤维化，但是将其应用于临床尚有很多问题需要解决，如回输路径、细胞的分布情况等。 目的：探讨PKH26荧光标记的大鼠内皮祖细胞在慢性肝损伤肝内迁移过程中的示踪。 设计、时间及地点：细胞学体内实验，于2008-08/2009-02在北京大学人民医院肝病研究所完成。 材料：SPF级健康成年SD大鼠100只，由解放军军事医学科学院动物中心提供。红色荧光染料PKH26为SIGMA公司产品。 方法：取16只大鼠，贴壁法分离培养内皮祖细胞，并行PKH26体外标记。实验设立3组：正常对照组4只大鼠，不进行任何干预；二甲基亚硝胺组40只大鼠，通过腹腔注射二甲基亚硝胺 10 mg/kg建立肝纤维化模型；四氯化碳组40只大鼠，通过四氯化碳/橄榄油灌胃建立肝纤维化模型。造模后，二甲基亚硝胺组、四氯化碳组大鼠经尾静脉注入1 mL PKH26标记的内皮祖细胞悬液(1×106个细胞)。 主要观察指标：PKH26标记率和细胞存活率，通过荧光共聚焦显微镜观察大鼠损伤肝内内皮祖细胞的迁移及CD31的表达。 结果：流式细胞仪检测结果显示PKH26标记的内皮祖细胞阳性率为99%，荧光显微观察发现锥虫蓝染色后PKH26标记细胞存活率均>90%。输注1 d后，两种慢性肝损伤模型中的肝内均可见PKH26标记阳性的细胞出现在肝小叶内，并且随时间延长阳性细胞数增加。PKH26标记阳性的细胞主要存在于沿纤维分布的血管内皮和肝小叶内的窦内皮，且血管内皮可见CD31/PK26双阳性细胞。 结论：PKH26可以在体外成功标记大鼠内皮祖细胞，并在损伤肝内示踪。     

干扰素刺激基因ISG20真核表达载体的构建及其抗丙型肝炎病毒复制作用的研究

目的：研究IFN—α抗HCV的作用机理及了解ISG20是否参与介导IFN-α对HCV的抑制作用。方法：用RT—PCR法及融合PCR法分别获得野生型及突变型ISG20cDNA，并将其克隆到真该表达载体pcDNA3．1上，转染含HCV复制子的Huh7细胞进行瞬时表达，通过Northern blot及Western blot分别检测HCVRNA及NS5A蛋白水平，研究表达ISG20对HCV复制子的影响。结果：构建的野生型及突变型ISG20真核表达载体在mRNA水平及蛋白水平的表达均得到证实，并且发现表达野生型ISG20对HCV复制子RNA有抑制作用。结论：成功克隆及表达了ISG20，并对其抗病毒作用进行了初步研究，提示ISG20可能介导IFN-α对HCV的抑制作用。     

粒细胞集落刺激因子动员对大鼠内皮祖细胞体外扩增的影响

背景：内皮祖细胞在缺血性疾病治疗应用中存在数量低的问题，许多细胞因子影响其动员效果和功能。 目的：观察粒细胞集落刺激因子动员对体外扩增骨髓源性内皮祖细胞数量及功能的影响。 设计、时间及地点：细胞学体外观察，于2007-08/2008-03在北京大学人民医院肝病研究所完成。 材料：SPF级健康成年SD雄性大鼠16只，随机分为动员组和对照组，8只/组。重组人粒细胞集落刺激因子为麒麟鲲鹏生物药业有限公司产品。 方法：实验前动员组大鼠皮下注射经生理盐水稀释的重组人粒细胞集落刺激因子10μg/kg，2次/d，共5 d。采用密度梯度离心法分别从两组大鼠骨髓获取单个核细胞，洗涤后按2×107/孔接种在包被大鼠纤连蛋白的6孔板上，采用贴壁法纯化得到内皮祖细胞。 主要观察指标：骨髓单个核细胞集落数及细胞表型，骨髓源性内皮祖细胞贴壁情况及细胞表型，通过DiI-acLDL摄取、体外血管生成进行内皮祖细胞功能学鉴定，透射电镜观察细胞超微结构。 结果：与对照组比较，动员组骨髓单个核细胞集落增多，CD45+/CD34+、CD133+和Flk-1+阳性率均明显升高（F=5.655~61.892，P < 0.05）。培养第7，9天与对照组比较，动员组骨髓源性内皮祖细胞贴壁数、CD45+/CD34+、CD133+和Flk-1+阳性率均明显升高（F=5.694~38.879，P < 0.05）。贴壁细胞F1TC-UEA-1/Dil-acLDL双荧光染色阳性率为90%，接种于Matrigel包被的培养板24 h后形成毛细血管索样结构，胞质内有Weibel-Palade小体存在。 结论：粒细胞集落刺激因子动员能增加骨髓源性内皮祖细胞的数量，并促进其分化、增殖功能。     

乙型肝炎病毒前C区和BCP区突变株复制质粒的构建

目的　构建乙型肝炎病毒 (HBV)前C区和基本核心启动子区 (BCP)突变株的复制质粒。方法　以含 1 2倍拷贝HBVDNA全基因的质粒 (pHBV1 2 )为工具 ,采用分子克隆、PCR定点诱变、限制性酶切长度多态性和序列分析等技术构建目的质粒。转染肝癌细胞株Huh7后 ,测定培养上清HBsAg、HBVDNA来了解病毒抗原的表达和病毒复制。结果　成功构建了 10种HBV全基因前C区 /BCP区突变的表达质粒 ,转染肝癌细胞株 ,获得病毒的表达和病毒颗粒的分泌。其中 ,pUC HBVT176 2、A176 4双突变以及pUC HBVT175 3突变株复制效率较高 ,转染细胞培养上清的HBVDNA为3 16× 10 5拷贝 ml。野生型复制子培养上清HBVDNA含量稍低于BCP突变复制子。结论　获得 10株含有不同前C区和BCP区突变的HBV全基因复制质粒 ,为体外进一步研究上述变异的生物学意义提供基本模型。