我国HIV-1 B''亚型毒株gag基因变异特征研究

目的研究我国人免疫缺陷病毒1型（HIV-1）B’亚型主要流行株在宿主免疫压力下的基因变异及抗原表位的变化特征，探讨选择压力、基因离散率和抗原表位变化之间的关系。方法从确诊的HIV-1感染者的全血样本中提取基因组DNA，经套式聚合酶链反应（PCR）扩增后，将扩增产物进行纯化和测序。然后将所得序列进行系统进化树和氨基酸变异分析，使用GCG软件包的Distance程序对P17和P24两个区段计算基因距离，用Diverge程序计算同义替换（1（s）和非同义替换（1（a）及二者之间的比值，并对我国人群中较常见的HLA型别限制的CTL表位的突变情况进行分析。结果HIV-1B’亚型毒株的P17区段的Ks／Ka值〈1，而P24区段的Ks／Ka值〉1；P24部分的基因离散率低于P17部分；P17区段抗原表位的保守率为34．94％，而P24区段抗原表位的保守率为67．38％；从基因离散率、所受的选择压力及抗原表位的突变率3个方面来看，HIV-1的P17区段均明显大于P24区段。结论HIV-1B’亚型毒株的P17区段的抗原表位变化较大，而P24区段的抗原表位相对较为保守。提示P24区段的CTL表位更适合于表位疫苗的研制。     

右旋柠烯抑制小鼠S-180移植瘤生长的实验观察

目的观察右旋柠烯乳剂(D-limonene)对小鼠移植瘤生长及转移的抑制作用。方法用小鼠S180癌性腹水建立皮下移植瘤模型,随机分为3组,预防组建模当天开始给药;治疗组移植后第5天开始给药;对照组不给药。每3d测量肿瘤大小,20d后取材,观察肿瘤细胞的浸润程度及淋巴结转移。结果对照组肿瘤体积较大,与皮肤及深部组织发生粘连,7只发现颈部或腋下淋巴结肿大。治疗组和预防组移植瘤生长速度明显缓慢,体积小,且瘤体较规则,未发现有淋巴结转移者。结论右旋柠烯有抑制肿瘤生长,减少淋巴结转移的作用,其机制有待进一步探讨。     

荧光定量PCR法在重组逆转录病毒pLXSN-BDNF滴度测定中的应用

目的制备含大鼠脑源性神经营养因子（BDNF）基因的逆转录病毒，建立荧光定量PCR测定滴度的方法。方法扩增BDNF基因，构建重组质粒pLXSN-BDNF，将其转染包装细胞，经G418筛选、病毒浓缩后用荧光定量PCR法和克隆形成法测定滴度。结果经PCR、酶切和测序鉴定，BDNF基因成功插入逆转录病毒载体中，筛选得到稳定的分泌重组病毒细胞系。重组病毒100倍浓缩后经荧光定量PCR法和克隆形成法测定的滴度分别为6．92×10^6拷贝/ml和3．2×10^5CFU/ml，两种方法测得的结果差异有统计学意义（P〈0．05）。结论成功扩增BDNF基因，制备了重组病毒pLX—SN-BDNF，建立了荧光定量PCR检测滴度的方法，为基因治疗青光眼性视神经损伤的实验研究提供重要参考指标。     

EIAV减毒疫苗诱导马外周血单个核细胞Th1型细胞因子的转录

目的：探讨马传染性贫血病毒驴白细胞减毒疫苗免疫马后,外周血单个核细胞中Th1型细胞因子转录水平与免疫保护应答的关系,揭示DLV的免疫保护机制。方法：应用分子克隆及实时定量RT-PCR技术,建立了马PBMC中IFNγ-、IL-2、IL-12 mRNA转录水平的定量检测方法,定期观察4组（疫苗免疫组、阴性对照组、强毒株阳性对照组、自然感染组）12匹马外周血PBMC中细胞因子的转录水平及分布特征,同时监测体温变化等指标。疫苗株免疫动物8个月后,用EIAV强毒株攻击,观察攻击前后细胞因子转录水平的变化。结果：DLV免疫马,在免疫后3周外周血PBMC中IFN-γ、IL-2转录量显著高于阴性对照组及自然感染组（P〈0.01）;免疫后用EIAV强毒株攻击,IFNγ-、IL-2和IL-12转录的量明显升高,免疫马获得完全保护;强毒株攻击阳性对照马IFN-γ、IL-2转录量随疾病进展波动,发热期下降。结论：本研究首次证明EIAV减毒疫苗可诱导马外周血PBMC中IFN-γ、IL-2、IL-12基因高效转录,其转录水平与DLV的免疫保护密切相关,此结果在分子水平为阐明DLV的免疫保护机制提供了新的实验依据。     

人vWF-A1区蛋白的表达及其对血小板聚集的抑制作用

目的:进一步研究血栓形成的机制,开发抗血栓药物。方法: 应用基因重组技术在大肠杆菌中表达人vWF-A1区蛋白,经过纯化、复性,获得重组蛋白(rvWF-A1),同时用流式细胞术检测rvWF-A1与血小板膜糖蛋白血小板膜糖蛋白(glycoprotein, GP)Ib的结合能力,应用血小板聚集仪测定rvWF-A1对瑞斯托霉素(ristocetin)诱导的血小板聚集抑制作用。结果: 重组表达载体pQE-31-vWF-A1在大肠杆菌M15中得到高效表达,表达的重组蛋白量占菌体总蛋白的30%,Ni-NTA agrose柱纯化后,其纯度为95%,经复性的rvWF-A1蛋白具有良好的生物学活性。它可与血小板模糖蛋白血小板膜糖蛋白GPIb结合,阳性率为78.6%;它可以抑制ristocetin诱导的血小板聚集,抑制率为84.7%。结论: 在原核细胞中可以成功地高效表达人vWF-A1区蛋白,该重组蛋白有可能开发为有效的抗血栓药物。     

血红素加氧酶1延长异种心脏移植存活的机制研究

探讨血红素加氧酶1(heme oxygenase-1,HO-1)在器官移植中抗急性血管排斥反应的作用。通过建立豚鼠到SD大鼠异位心脏移植模型,用血红素(hemin)分别诱导供者和受者,上调HO-1基因表达;用眼镜蛇毒因子、环孢素A抑制超急性排斥反应;观测供者心脏存活时间,并分别检测心脏组织HO-1表达、受者血清异种抗体IgM的变化及异种抗体IgM和C3在血管内膜的沉积;采用TUNEL方法检测心脏组织细胞凋亡;RT-PCR方法测定组织CD40L mRNA表达水平。结果显示:上调HO-1表达能明显延长心脏移植存活时间,抑制异种抗体IgM表达和在血管内膜的沉积,减少心肌细胞的凋亡并且抑制CD40L mRNA的表达。该结论表明HO-1通过介导CD40-CD40L共刺激途径抑制大鼠异种心脏移植后急性血管排斥反应,延长心脏移植存活时间。     

骨髓间充质干细胞复合羟基磷灰石/磷酸三钙植骨材料的体外研究

目的研究兔骨髓间充质干细胞(BMSCs)在羟基磷灰石/磷酸三钙(HA/TCP)植骨材料上的黏附增殖情况。方法抽取兔股骨骨髓,进行贴壁培养BMSCs。在成骨诱导液中诱导BMSCs,于7d用钙钴法检测碱性磷酸酶活性,10d进行茜素红矿化结节染色;在成脂诱导液中诱导BMSCs,于21d进行油红O染色。将BMSCs接种到HA/TCP植骨材料上,加入成骨诱导液,采用倒置显微镜、荧光显微镜及扫描电镜检测,并采用四氮唑蓝(MTT)比色法测定HA/TCP植骨材料上BMSCs的增殖情况。结果BMSCs在成骨诱导液中7d碱性磷酸酶呈强阳性,10d矿化结节染色呈橘红色;在成脂诱导液中,21d油红O染色呈阳性。BMSCs在HA/TCP植骨材料上孔隙周围及孔隙内生长良好并大量增殖。MTT分析结果显示,HA/TCP对BMSCs的体外增殖无抑制作用。结论BMSCs与HA/TCP植骨材料有良好的生物相容性。     

巢蛋白和阶段特异性胚胎抗原-1在大鼠2型星形胶质细胞中的表达

目的 观察1型和2型星形胶质细胞(T1A、T2A)是否表达神经干细胞的标志物、是否具有神经干细胞的特性.方法 取新生大鼠脑皮质,体外培养纯化的O-2A祖细胞、T1A和T2A,应用激光共焦双重免疫荧光标记技术检测巢蛋白和阶段特异性胚胎抗原-1(SSEA-1)的表达;观察O-2A祖细胞、 T1A和T2A在碱性成纤维生长因子(bFGF)和表皮生长因子(EGF)的培养液中生长方式的改变.结果 巢蛋白在O-2A祖细胞和T2A中表达,T1A不表达;SSEA-1仅在T2A中表达.在干细胞培养基中培养10d,T2A形成能增殖和连续传代的细胞球,细胞球巢蛋白标记阳性,贴壁后分化细胞具有神经元、星形胶质细胞和少突胶质细胞样形态;但相同培养条件下的O-2A祖细胞和T1A生长方式无改变.结论 巢蛋白和SSEA-1在两型星形胶质细胞中的表达存在差异,T2A具有神经干细胞的某些生物学特性.     

建立一种用重组蛋白检测抗口蹄疫病毒抗体的间接ELISA方法

目的研究以重组蛋白作为包被抗原检测口蹄疫病毒（FMDV）感染后的动物血清中特异性抗体的可能性,为建立一种非病毒颗粒的ELISA检测试剂盒提供实验依据。方法利用自行构建表达的O型口蹄疫病毒VP1表位肽重组蛋白（VP1epi）作为包被抗原,采用间接ELISA方法确定抗原的最佳工作浓度和包被方法,优化各项实验条件,并以FMDV感染后的豚鼠血清作为标准阳性血清确定ELISA方法的特异性和灵敏度。结果FMDV感染后的阳性豚鼠血清可以很好地识别VP1epi重组蛋白,用此蛋白包被检测抗FMDV抗体的灵敏度可达1∶3200,并证明所检测的抗体是FMDV特异性的。结论VP1epi重组蛋白可以替代FMDV颗粒用于建立检测抗FMDV抗体的ELISA试剂盒。     

陕西、青海、新疆三省(区)部分人群庚型肝炎病毒血清学调查

目的：调查陕西、青海、新疆三省（区）部分人群庚型肝炎病毒（HGV／GBV）血清学特征。方法：采用ELISA方法，共调查三省（区）1469份血清中GBV－IgG抗体。结果：少数民族血清GBV－IgG抗体的阳性率（藏族4．11％，蒙古族5．36％，维吾尔族4．55％，回族4．00％）略高于汉族（1．36％－1．73％），但差异无显著性（P＞0．05）；吸毒人群GBV－IgG阳性率（11．30％，34／301）明显高于正常人群（2．44％，18／736），（P＜0．01）；献血员GBV－IgG阳性率为1．02％－7．68％。结论：三省区民族间GBV－IgG抗体阳性差异无显著性，血源性传播是其重要途径，应加强对献血员及吸毒人员的监管。