人血管生成素1的克隆、序列分析和单酶切法构建毕氏酵母表达载体

目的:从人胎盘中克隆血管生成素1基因,并分析其结构特征,单酶切法构建毕氏酵母表达载体pPIC9K/Ang-1,为进一步研究血管生成素1防治糖尿病视网膜病变的血管渗漏奠定物质基础。方法:实验于2003-11/2004-06在北京大学医学部细胞系完成。提取人胎盘组织总RNA,用反转录聚合酶链式反应技术扩增出血管生成素1基因片段,并将其克隆到PGEM-TEasy载体中进行序列分析,用小牛肠碱性磷酸酶法去除线性化的pPIC9K质粒DNA两端磷酸基,以防止质粒自身环化,再亚克隆到毕氏酵母表达载体pPIC9K中。结果:①经甲醛变性胶电泳鉴定,成功从胎盘组织中提取出总RNA,RNA的完整性和纯度符合进一步的酶反应要求。②胎盘组织总RNA经oligo-dT引物反转录,用人血管生成素1特异一对引物进行聚合酶链反应扩增,10g/L琼脂糖胶电泳结果显示一条特异片段,大小为1.5kbcDNA片段。③成功构建了PGEM-T/Ang-1载体,Blast序列分析与GenBank中AY121504一致。两者成熟区cDNA的核苷酸和氨基酸同源性分别大于99%和98%,国人血管生成素1基因核苷酸序列的起始密码子ATG,终止密码子为TGA,共1497个碱基对。④成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体。结论:从人的胎盘中克隆血管生成素1基因无突变,成功构建pPIC9K/Ang-1毕氏酵母表达载体,满足表达蛋白质的需要。     

大鼠抗组胺药敏感性细胞色素P450基因的克隆及其反转录病毒载体的构建和鉴定

目的:构建反转录病毒表达载体pLXSN-HP450。方法:实验于2004-12/2006-05在广西医科大学生化药理实验室完成。提取正常的Wistar大鼠肝组织的总RNA,反转录-聚合酶链反应技术扩增出抗组胺药敏感性细胞色素P450(HP450)基因。并克隆到pMD18-T载体,经蓝白斑筛选后进行聚合酶链反应,酶切,测序鉴定。BamHI,EcoRI双酶切构建好的重组质粒和反转录病毒载体pLXSN在16℃下经T4连接酶连接过夜,并转化到感受态细胞DH5α,以菌液为模板做聚合酶链反应,结合酶切筛选及鉴定阳性重组反转录病毒载体pLXSN-HP450。结果:反转录-聚合酶链反应扩增出HP450基因。重组质粒pMD18-HP450经双酶切后得到1461bp的酶切产物。测序的结果用ClustalW在线与Genebank对比,此目的基因与基因库中的H1基因100%同源。阳性重组载体pLXSN用其菌液聚合酶链反应扩增出目的条带。对重组体pLXSN-HP450进行双酶切得到1461bp和5900bp两条特异性条带。结论:克隆了HP450基因,并成功构建了重组反转录病毒载体pLXSN-HP450,为进一步研究肝癌的基因治疗奠定了基础。     

黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞增殖及再灌注后内皮细胞与中性粒细胞黏附的影响

目的:观察黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞的增殖效应及其对再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞与人外周血中性粒细胞黏附作用的影响。方法:实验于2006-07/12在北京中医药大学东直门医院中医内科重点实验室完成。①实验材料:原代人心脏微血管内皮细胞(ScienCell公司);黄芪多糖(惠州市东方植物保健科技有限公司)。②实验过程及评估:实验使用体外培养的人心脏微血管内皮细胞第4,5代细胞,采用倒置相差显微镜下观察细胞形态和生长情况;以四甲基偶氮唑盐法检测经不同浓度黄芪多糖处理24h,以及经黄芪多糖100,50,25mg/L分别处理4,6,8h后的增殖变化;以体外缺糖缺氧2h模拟体内缺血,复糖复氧6h模拟再灌注复制人心脏微血管内皮细胞再灌注损伤模型;虎红法测定经缺氧再复氧处理后的人心脏微血管内皮细胞与外周血中性粒细胞的黏附;免疫细胞化学法和图象定量分析系统观察细胞间黏附分子1的蛋白表达变化。结果:①人心脏微血管内皮细胞形态和生长情况:人心脏微血管内皮细胞复苏48～72h后细胞呈铺路石样生长,在15个细胞倍增周期内,其形态、生物、生理学特性稳定。②不同浓度黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞增殖的影响:黄芪多糖浓度≥5g/L时,对细胞生长具有抑制作用(P<0.05或0.01);浓度为2.5g/L时,对细胞的增殖无影响;浓度在1.25g/L～18.78mg/L时,可明显促进细胞的增殖(P<0.05或0.01)。③黄芪多糖处理不同时间对人心脏微血管内皮细胞增殖的影响:经黄芪多糖100,50,25mg/L3个剂量分别处理4,6,8h后,其增殖与正常对照组比无明显变化。④黄芪多糖对人心脏微血管内皮细胞与中性粒细胞间黏附作用及人心脏微血管内皮细胞细胞间黏附分子1蛋白表达的影响:黄芪多糖50mg/L可显著抑制再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞与外周血中性粒细胞的黏附(P<0.01);100mg/L可明显降低人心脏微血管内皮细胞的细胞间黏附分子1蛋白表达(P<0.05)。结论:①黄芪多糖在一定浓度范围内可促进人心脏微血管内皮细胞的增殖,但需较长的作用时间才能发挥促增殖效应。②黄芪多糖对缺血再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞具有保护作用,其作用机制可能与促进再灌注损伤人心脏微血管内皮细胞增殖修复,降低人心脏微血管内皮细胞表面细胞间黏附分子1蛋白表达,进而抑制与外周血中性粒细胞的黏附有关。     

家兔慢性冬眠心肌模型的建立

目的:建立家兔慢性心肌冬眠模型。RA方法:实验于2006-02/12在福建省冠心病研究所完成。实验分组:选择健康家兔30只,按随机数字表法分为模型组(n=18)和假手术组(n=12)。模型组采用开胸不全结扎冠状动脉左前降支中段,关胸后继续喂养1个月,造成心肌慢性缺血,构建家兔慢性冬眠心肌模型。假手术组仅开胸不作冠状动脉左前降支中段结扎。实验评估:①采用冠状动脉造影观察冠状动脉左前降支中段狭窄程度。②超声心动图、多巴酚丁胺超声心动图负荷实验观察慢性缺血心肌室壁运动情况。③氯化三苯基四氮唑染色检测心肌坏死程度。④苏木精-伊红常规染色利用光学显微镜观察心肌组织结构变化。⑤苦味酸-天狼猩红胶原纤维染色观察心肌间质胶原纤维增生情况。结果:术后模型组家兔15只和假手术组12只进入结果分析。①狭窄程度:模型组冠状动脉左前降支中段直径平均狭窄率为(84.90±4.24)%,假手术组未见明显狭窄。②左心室整体收缩功能:模型组左室射血分数、短轴缩短率显著低于假手术组,差异有显著性意义(t=10.314,11.938,P<0.01)。③心肌室壁运动情况:静息时模型组左室壁异常运动节段47个。多巴酚丁胺超声心动图负荷实验34个节段出现室壁运动障碍程度先加重而后改善的典型冬眠心肌的双相反应。④心肌坏死程度:氯化三苯基四氮唑染色显示模型组3只家兔出现小灶性透壁心肌坏死,其余12只家兔均未发现心肌坏死。假手术组12只家兔均未发现心肌坏死。⑤心肌组织结构变化:苏木精-伊红染色显示模型组心肌纤维肿胀,染色不均匀,横纹模糊,核周水肿;假手术组心肌纤维排列整齐、连接紧密。⑥心肌间质胶原纤维增生情况:苦味酸-天狼猩红胶原纤维染色显示模型组心肌间质、血管周围可见大量胶原纤维,呈不规则网状或团块状;假手术组心肌间质、血管周围见零星分布的胶原纤维。结论:采用开胸不全结扎冠状动脉左前降支中段建立家兔慢性心肌冬眠模型是可行的。     

Time-dependent association between metabolic syndrome and risk of CKD in Korean men without hypertension or diabetes

BACKGROUND: The time-dependent association between metabolic syndrome and risk of chronic kidney disease (CKD) is not clear. STUDY DESIGN: Prospective cohort study. SETTING & PARTICIPANTS: The study cohort was composed of 10,685 healthy men without CKD, hypertension, or diabetes who participated in a health-checkup program at a large work site. PREDICTOR: Metabolic syndrome. OUTCOMES & MEASUREMENTS: CKD was defined as an estimated glomerular filtration rate (GFR) less than 60 mL/min/1.73 m(2). A standard Cox proportional hazards model and a time-dependent Cox model were used to calculate adjusted hazard ratios (HRs) in the CKD model. RESULTS: During 40,616.8 person-years of follow-up, 291 incident cases of CKD developed; 787 patients (7.4%) had metabolic syndrome at baseline and 1,444 (14.4%) developed incident metabolic syndrome during follow-up. After adjustment for age, baseline GFR, gamma-glutamyltransferase level, and uric acid level, metabolic syndrome at baseline was associated with a significantly increased risk of CKD (HR, 1.99; 95% confidence interval, 1.46 to 2.73). Metabolic syndrome over time as a time-dependent variable also predicted the development of CKD (HR, 1.83; [corrected] 95% confidence interval, 1.34 to 2.49) [corrected] The relationship between metabolic syndrome and incident CKD remained significant, even after further adjustment for the homeostasis model assessment of insulin resistance, high-sensitivity C-reactive protein level, current smoking, alcohol consumption, or regular exercise. In addition, there were graded relationships between number of metabolic syndrome traits or quintile of homeostasis model assessment of insulin resistance over time as a time-dependent variable and risk of CKD. Both increased triglyceride and low high-density lipoprotein cholesterol levels among metabolic syndrome traits were associated with significantly increased risk of CKD. These results were effectively unchanged, even after additional adjustment for incident hypertension and incident diabetes. LIMITATIONS: Estimated GFR was used instead of a directly measured GFR to define CKD. CONCLUSION: Metabolic syndrome is an independent risk factor for the development of CKD in Korean men without hypertension or diabetes, even with changes in status of metabolic syndrome over time.     

造血干细胞移植患者的心理护理

1 临床资料我院2000-06/2003-06共收治造血干细胞移植42例(男22,女20),年龄16～42(平均27)岁,其中异基因外周血干细胞移植12例,自体骨髓移植10例,自体外周血干细胞移植10例,异基因骨髓移植10例.自体骨髓移植及自体外周血干细胞移植为急性白血病,异基因骨髓移植,异基因外周血干细胞移植为慢性粒细胞白血病.研究组21(男10,女11)例.对照组21(男12,女9)例.对照组入层流室后给予常规治疗和护理,研究组入层流室后除进行常规治疗和护理外,运用护理程序对患者进行评估,将患者在不同治疗阶段的心理特点分为3期,然后根据每期特点进行心理护理.具体措施: ①焦虑孤独期为初进层流室患者突然与外界隔离,易产生孤独感及焦虑情绪.护理人员要主动向患者介绍层流室的环境及其重要性,尽量减少环境产生的陌生感.应多利用对讲系统,加强患者与家属的联系与交流,使患者情绪稳定,有利于治疗的顺利进行.     

The impact of HLA-DRB1*0405 on disease severity in Korean patients with seropositive rheumatoid arthritis

Many reports have described HLA-DRB1 genes as having an influence on disease severity and susceptibility in rheumatoid arthritis (RA). Studies were undertaken to define the effect of RA-associated alleles on disease severity in Korean patients with seropositive RA. The results indicate that the most common RA susceptibility allele, HLA- DRB1*0405, is significantly associated with bony erosion, joint deformity and extra-articular manifestations. However, RA-associated alleles in Koreans have less effect on nodular disease than in Caucasians. This suggests that the presence of RA-associated alleles, especially HLA-DRB1*0405, seems to be a prognostic marker for severe erosive disease in Koreans.      

嗅鞘细胞研究的历史回顾

目的:嗅鞘细胞移植在脊髓损伤、神经系统脱髓鞘疾病等领域的潜在治疗作用日渐凸现,文章就嗅鞘细胞名称规范和近百年研究历史简况作一归纳总结。方法:应用计算机检索PUBMED1900-01/2007-04期间的相关文章,检索词为“olfactory in title,abstract”,不限定文章语言种类。同时计算机检索中国期刊全文数据库1979-01/2007-04期间的相关文章,题名检索词为“嗅,细胞”,关键词为“嗅,胶质,细胞”,并限定文章语言种类为中文。对资料进行初审,并查看每篇文献后的引文。文章所述内容应与嗅鞘细胞名称规范及其历史简况研究相关,排除重复研究或Meta分析类文章。结果:共收集到22904篇相关文献,228篇文献符合纳入标准,排除的文献为内容无关、陈旧或重复。入选文献涵盖嗅鞘细胞研究的所有方面,对嗅鞘细胞的不同名称进行全面收集和整理,汇总英文名称和中文译名各9个,提出推荐名称;总结了嗅鞘细胞研究领域的国内外发展趋势;回顾复习嗅鞘细胞的生物学特性、形态学特征、培养、建系及鉴定、移植治疗各种动物疾病模型实验、具体临床应用等内容。结论:大量基础实验和近年来临床研究均表明,嗅鞘细胞是一种特殊类型的胶质细胞,对中枢神经系统多种疾病具有广阔的治疗前景,值得深入研究,以进一步提高患者的临床治疗效果。     

肠缺血再灌注大鼠肺及血液白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α变化与辅酶Q10的干预

目的:观察大鼠肠缺血再灌注时肺及血液白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α的变化以及辅酶Q10的影响。方法:实验于2006-12/2007-02在滨州医学院药理学实验室和免疫学实验室(山东省重点学科三级实验室)完成。①实验分组:清洁级健康Wistar大鼠30只,体质量290～390g,随机数字表法分为假手术组、肠缺血再灌注组,辅酶Q10处理组(缺血再灌注 辅酶Q10),每组10只。②实验方法:建立肠缺血再灌注模型,钝性分离肠系膜上动脉的根部,假手术组不作其他处理;肠缺血再灌注组再灌前30min时经股静脉注入生理盐水10mL/kg;辅酶Q10处理组再灌前30min时经股静脉注入辅酶Q1010mg/kg。③实验评估:酶联免疫吸附法(ELISA)检测各组动物血液、肺组织匀浆及肺泡灌洗液中的白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α含量;光镜下观察肺组织形态学变化。肺泡灌洗液沉渣进行白细胞计数和分类。结果:纳入大鼠30只,均进入结果分析。①肺组织形态学变化:假手术组肺组织无病理改变;肠缺血再灌注组肺间质明显水肿,中性粒细胞浸润,有少量的出血和纤维蛋白渗出;辅酶Q10处理组肺间质轻度水肿,少量的中性粒细胞。②肺泡灌洗液白细胞计数组间无显著性差异,多形核细胞分类肠缺血再灌注组明显高于假手术组(P<0.05),而辅酶Q10处理组与其他两组间差异无显著性意义(P>0.05)。③各组动物血液、肺组织匀浆及肺泡灌洗液中的白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α含量:与假手术组比较,肠缺血再灌注组血液、肺组织匀浆及肺泡灌洗液中白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α显著升高(P<0.05或P<0.01)。与肠缺血再灌注组比较,辅酶Q10处理组血液、肺组织匀浆和肺泡灌洗液中白细胞介素6含量显著降低(P<0.05);白细胞介素8和肿瘤坏死因子α含量在血液中显著降低(P<0.05);而在肺组织匀浆中含量未见显著降低(P>0.05);在肺泡灌洗液中含量亦未见显著降低(P>0.05)。结论:辅酶Q10可能通过抑制白细胞介素6、白细胞介素8和肿瘤坏死因子α炎性因子的释放,对大鼠肠缺血再灌后肺损伤有一定的保护作用。