CD59融合蛋白表达载体构建及其在大肠杆菌中的表达

探索ＧＰＩ－锚固蛋白的体外表达，获得具有生物学活性的可溶性游离ＣＤ５９分子。方法通过ＰＣＲ选择性扩增编码成熟ＣＤ５９氨基酸序列的基因片段，并将之克隆入ＰｉｎＰｏｉｎｔＸａ－３质粒中。ＩＰＴＧ诱导融合蛋白表达，产物经亲和素树脂亲和层析。在丛外微量反应性溶血抑制实验中检测重组ＣＤ５９纯化样品的生物学活性。     

蛋白质组学教学方法探讨

过去蛋白质研究的根本缺陷在于孤立地研究单个蛋白质的结构、功能、表达以及与疾病的关系。但是,人体或自然界的生物并不仅仅是各种蛋白质的混合物,而是一个统一的整体。一种蛋白质的缺陷可能导致其它相关蛋白质含量的改变,或者由其它的蛋白质加以代偿。因而从单一蛋白质出发,无论是进行疾病的论断还是生物技术,都将是不全面的。     

重组α-病毒的制备和鉴定

目的 探讨从DNA水平制备重组α-病毒的新途径，寻找更简便的制备重组α-病毒疫苗的新方法。方法 将表达β-半乳糖苷酶的载体和包装载体用磷酸钙法共转染BHK包装细胞，收集并纯化上清中的病毒。再用该病毒在体外感染BHK细胞，鉴定所制备病毒滴度和目的基因的表达情况。结果 用本方法制备出了较高效价的重组病毒，并能在哺乳细胞中很好地表达。结论 从DNA水平可以制备出较高滴度的重组α-病毒，这种方法可以扩展用于基因治疗和疫苗的制备。     

脱脂棉及尼龙棉柱分离纯化T淋巴细胞的比较研究

目的：建立脱脂棉柱纯化人外周血T淋巴细胞的方法，并与尼龙棉柱分离法进行比较。方法：密度梯度离心法分离人外周血单个核细胞，通过玻璃器皿黏附的方法去除其中的单核巨噬细胞，再分别以脱脂棉柱或尼龙棉柱纯化T淋巴细胞。纯化的T淋巴细胞经流式细胞仪检测T淋巴细胞纯度，台盼蓝排斥实验检测纯化T细胞活力。结果：脱脂棉及尼龙棉柱滤过法对纯化T细胞的活力均无影响。结论：脱脂棉柱滤过分离法可以代替尼龙棉柱法获得高纯度高活性的T淋巴细胞。     

SARS-CoV S1蛋白基因克隆及其在Vero E6细胞中的表达

目的：克隆表达SARS-CoV S1蛋白，构建SARS基因疫苗。方法：从SARS病毒的cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1蛋白的编码序列，将该序列克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western blot检测S1蛋白的表达。结果:PCR方法扩增出2000bp左右的基因片段，插入pVAXl构建重组表达载体后，经序列测定证实扩增的片段为SARS-CoV Tor2株S1蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoV S1蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

SSX基因家族HLA-A2.1限制性CTL表位预测及其MHC-Ⅰ亲和力分析

目的通过对肿瘤基因SSX家族不同成员进行CTL表位预测,并对其与MHC-Ⅰ亲和力进行分析,为探索基于SSX肿瘤基因家族的免疫治疗奠定基础。方法利用基于超基序结合量化基序方案开发的HLA-A2.1限制性CTL表位预测软件,对SSX基因家族不同成员进行CTL表位预测,然后合成SSX相关待测表位肽P1(AMTKLGFKA)、P4(AMT-KLGFNV)、P5(AMTKLGFKV)和P6(VMTKLGFKV),再对这些合成肽与MHC-Ⅰ结合亲和力及其结合物稳定性进行实验分析。结果与实验阳性肽(HBcAg,18~27)相比,除P1外,P4、P5、P6均显示较高的结合亲和力;而结合稳定性实验(DC50)结果显示,P1、P4与阳性对照肽(HBcAg,18~27)DC50均大于8 h,而P5和P6的DC50介于2~4 h之间。结论计算机软件预测的CTL表位肽,经过体外亲和力与结合稳定性实验筛选到2条理想的表位肽,为该表位的下一步体内鉴定奠定基础。     

人DcR3 cDNA克隆及其在COS-7细胞中的表达

目的 克隆人DcR3分子的cDNA,将其重组入真核表达载体,并表达于COS-7细胞.方法 以PCR方法克隆编码人DcR3分子的cDNA,对其序列进行测定.将测序正确的DcR3 cDNA克隆入真核表达载体pAAV-IRES-hrGFP,构建重组表达载体.采用脂质体法转染COS-7细胞,用Western blot检测和激光共聚焦检测重组DcR3分子在COS-7细胞中的表达.结果 PCR方法扩增出一1 000 bp左右的基因片段,插入pAAV-IRES-hrGFP构建重组表达载体后,经序列测定证实扩增的片段为人DcR3分子cDNA.将重组子转染COS-7细胞,Western blotting和激光共聚焦检测到DcR3分子的表达.结论 成功地克隆并在COS-7细胞中表达了DcR3分子.     

GPI锚固型CD46/CD55嵌合分子的设计及构建

目的：选取调控补体活化中心环节C3转化酶的两种膜调节蛋白CD46和CD5，设计构了新型的GPI锚固型CD46／CD55嵌合分子，方法：以CD46cDNA和CD55cDNA为模板，通过PCR及PCR重叠延伸技术（SOE）得到CD46／CD55嵌合cDNA。为避免双分子连接后的空间结构和功能变化，在CD46和CD55之间引入了多肽氨基酸接头（Linker)，然后克隆构建GPI锚固型CD46／CD55－Bluescripy M13克隆载体，结果：获得了阅读框完整，连接部位正确的GPI锚固型CD46／CD55嵌合分子cDNA，结论：本为研制开发新一代的多功能，多靶点的补体抑制剂奠定了基础。     

靶向DC-SIGN的Le(x)-OVA抗原的制备

目的制备用于靶向DC-SIGN受体的Le(x)寡糖介导的靶向抗原.方法利用Sulfo-SMCC异源双功能交联试剂交联链霉亲和素(streptavidin,SA)和模式抗原卵白蛋白(ovalbumin,OVA),再利用SA与生物素高亲和力结合的特性,将SA-OVA复合物与生物素修饰的Le(x)寡糖反应,由此获得由Le(x)寡糖介导的靶向抗原Le(x)-OVA复合物.结果应用SDS-PAGE蛋白质电泳和Western免疫印迹方法证实SA与OVA蛋白成功交联,ELISA方法证实SA-OVA复合物中的SA仍具有与生物素反应的功能,根据SA-OVA复合物与生物素修饰的Le(x)寡糖饱和反应的比例,获得所需要的靶向抗原Le(x)-OVA复合物.结论获得Le(x)寡糖介导的靶向抗原Le(x)-OVA复合物,为进一步研究经由DC-SIGN靶向后的抗原特异性免疫应答奠定了基础.     

可溶性嵌合补体抑制分子的构建及表达

目的：制备能抑制补体活化的2个关键环节（C3/C5转化酶和MAC的形成）的一种新型、高效补体抑制剂。方法：先设计引物，然后通过PCR技术扩增重组可溶性CD46/CD55/CD59嵌合分子cDNA片段，重组于pSecTagA真核表达载体上，分别利用COS-7细胞和中国仓鼠卵巢（Chinese hamster ovary，CHO）细胞进行表达，并用抗人CD46多克隆抗体及抗人CD55、CD59单克隆抗体对表达产物进行western bolting鉴定。结果：DNA测序证实，前端带有小鼠IgGκ链前导序列，后端融合有编码6个组氨酸碱基的CD46/CD55/CD59嵌合分子cDNA片段的阅读框完整。免疫印迹结果显示，表达的重组蛋白分别能与抗人CD46多克隆抗体和抗人CD55、CD59单克隆抗体结合。结论：成功构建并在真核细胞内表达了重组可溶性CD46/CD55/CD59嵌合分子，为进一步研制和开发新一代多功能、多靶点补体抑制剂奠定了基础。