人/鼠嵌合模型中人重组α-病毒疫苗的免疫学作用评价

目的 建立人／鼠嵌合模型(Trimera)，并研究重组α-病毒在此模型中对人黑色素瘤的免疫学作用。方法 构建人／鼠嵌合模型并用流式细胞术进行鉴定。构建重组病毒和重组质粒并在体外转染鉴定其表达。疫苗免疫动物后检测特异抗体滴度和细胞毒T淋巴细胞活性。结果 FACS分析发现，人白细胞占Trimera小鼠腹腔淋巴细胞的88．84％，脾脏中为57％。免疫后的小鼠腹腔细胞在效／靶比为100：1时，细胞毒T淋巴细胞的杀伤率达到70％，psMART2a/MAGE-3和pCI-neo／MAGE-3免疫小鼠的杀伤率为分别为50％和30％左右。ELISA结果显示，重组病毒MAGE-3／SFV和重组质粒pSMART2a／MAGE-3免疫小鼠后产生的MAGE-3特异抗体的效价均达到1：512，重组质粒pCI-neo／MAGE-3免疫动物后的抗体效价为1：256。结论 成功建立了人／鼠嵌合模型，并在动物体内有效激发了针对人黑色素瘤MAGE-3蛋白的初次免疫应答；重组α-病毒疫苗和基于α-病毒复制酶的基因疫苗免疫效果要好于常规基因疫苗。     

PD-L1 mAb的制备、鉴定及其特性的研究

目的制备抗程序化死亡配体-1(Programmed Death-Ligand 1,PD-L1)的mAb杂交瘤细胞系并对其分泌的抗体特性进行研究。方法用我室纯化的PD-L1／IgG4 Fc融合蛋白免疫Balb／c小鼠,取小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞SP2／0进行融合,经筛选和克隆化后,建立杂交瘤细胞系。以Western-blot等方法研究抗体特性。结果得到3株能够稳定分泌抗体,效价高的杂交瘤细胞系2D10、1C3和1A6,Western-blot显示2D10、1C3和1A6能与PD-L1(Mr为5800)结合。结论得到杂交瘤细胞系稳定分泌的mAb,在抗病毒免疫、抗肿瘤反应和自身免疫性疾病的免疫诊断和／或治疗方面可能有广阔的应用前景。     

微量免疫法制备小鼠抗人补体C9抗血清

目的　建立一种简便有效的免疫方法 ,制备抗人补体C9抗血清。方法　将鉴定好纯度的免疫原稀释至恰当浓度 ,以硝酸纤维素膜吸附抗原 ,将之埋入小鼠背部皮下 ,并再次免疫 1～ 2次。间接ELISA法鉴定抗血清效价 ,免疫印迹实验鉴定抗血清的免疫反应特异性。结果　间接酶联免疫吸附实验滴定抗血清的效价约为 1× 10 -5,抗血清对正常人血清成分进行的免疫杂交实验得到特异性的C9蛋白条带。结论　以硝酸纤维素膜吸附抗原的微量免疫方案获得特异性和效价均佳的免疫效果。     

诱骗受体3对大鼠移植肝脏的保护作用

目的将重组诱骗受体3（decoy receptor 3，DcR3）腺相关病毒（adeno-associated virus，AAV）感染移植肝，探讨DcR3对移植肝的保护作用。方法实验动物分为同基因肝移植组（G1）、同种异体肝移植组（G2）、AAV空病毒感染的同种异体肝移植组（G3）、重组DcR3／AAV感染的同种异体肝移植组（G4）。常规建立同种异体大鼠肝移植模型；术中取预先制备的浓缩1×10^9IU病毒颗粒感染移植肝；术后观察大鼠的存活时间、肝功能，荧光显微镜及光镜下观察DcR3在肝脏中的表达及肝脏病理改变。结果G4组的平均生存时间比G2、G3组显著延长，G2、G3组的平均生存时间差异无统计学意义。G4组大鼠术后15、20d的肝功能、肝脏病理改变分别与G2、G3组大鼠术后7、10d相似。结论DcR3对大鼠移植肝有显著的保护作用。     

SARS-CoVS蛋白全长基因克隆及其表达的初步研究

目的：克隆表达SARS-CoVS蛋白，构建SARS全长基因疫苗。方法：从SARS病毒的总cDNA中以PCR方法扩增编码人SARS-CoV S1和S2蛋白的编码序列，再将二者分别克隆入真核表达载体pVAX1，构建重组表达载体。然后进一步将S1和S2连接到pVAX1中。酶切和测序鉴定阳性克隆。采用脂质体法转染Vero E6细胞，用Western检测S蛋白的表达。结果：PCR方法分别扩增出了1900bp和1800bp左右的基因片段，两片段插入pVAX1构建重组表达载体后，经序列测定证实该插入片段为SARS病毒S蛋白编码序列。将重组子转染Vero E6细胞，收集细胞总蛋白，Western检测获得特异蛋白带。结论：成功克隆并表达了SARS-CoVs蛋白，为其作为SARS基因疫苗研究打下基础。     

Alzheimer病Aβ1-42肽和IL-4双基因表达质粒的构建和表达鉴定

目的构建Alzheimer病Aβ1-42基因和小鼠IL-4共表达质粒,探讨其作为Alzheimer病特异疫苗的可能性.方法全基因合成Aβ1-42基因片段并克隆入pMD18-T载体中,再从Aβ1-42/pMD18-T重组质粒中切下Aβ1-42基因并克隆入TA-CE5真核双表达载体中,构建重组质粒Aβ1-42/TACE5.从pUMMV-mIL4质粒中切下mIL-4并克隆到重组质粒Aβ1-42/TACE5中,构建双表达重组质粒Aβ1-42/mIL-4/TACE5测序鉴定克隆基因的正确性.脂质体试剂Lipofectamine 2000体外转染Aβ1-42/mIL-4/TACE5重组质粒于BHK-21细胞中,用ECL-Western-blot方法鉴定mIL-4和Aβ1-42能在该细胞中共表达.结果正确构建了Aβ1-42/mIL-4/TACE5双表达重组质粒,并且在转化此质粒的BHK-21细胞中检测出了Aβ1-42和mIL-4的表达.结论 双表达重组质粒Aβ1-42/mIL-4/TACE5基本可以满足其作为Alzheimer病特异的候选DNA疫苗的要求,为下一步的基因疫苗转基因动物体内免疫学实验提供了实验依据.     

基于α-病毒复制酶的基因疫苗对人黑色素瘤的免疫作用

目的研究基于α-病毒复制酶的人黑色素瘤基因疫苗免疫学作用.方法建立及鉴定人/鼠嵌合模型(trimera),将基于α-病毒复制酶的mage-3基因疫苗免疫动物,检测动物体内特异抗体滴度;用标准4 h51Cr释放实验检测动物体内特异CTL活性.结果FACS分析显示,trimera小鼠腹腔细胞中人白细胞占总细胞的88.84%,脾脏细胞中人白细胞的比例占57%,同国外文献报道一致.基于α-病毒复制酶的重组基因疫苗mage-3/pSMART2a对trimera小鼠免疫后,小鼠腹腔细胞的CTL在效靶比为100:l时杀伤率达到70%左右,此时的对照组mage-3/pCI-neo组最大杀伤率为40%左右.ELISA结果显示,重组基因疫苗mage-3/pSMART2a组产生的mage-3抗原特异性抗体效价达到1:512,mage-3/pCI-neo组为1:256.结论成功建立了人/鼠嵌合模型,并在动物体内激发出针对人黑色素瘤基因疫苗的初次免疫应答.     

人LIGHT基因的克隆及其在293T细胞中的表达

目的克隆人LIGHT分子的全长cDNA,构建重组真核表达质粒pCI-neo-LIGHT并在293T细胞上获得稳定表达.方法从人T细胞cDNA文库中用PCR技术克隆人LIGHT全长cDNA,装入T-Easy载体,测序证实后,将LIGHT cDNA装入质粒pCl-neo中构建真核表达载体.用电穿孔法转染293T细胞,经G418筛选后,用流式细胞仪检测LIGHT分子的表达.结果测序证实克隆的LIGHT全长cDNA阅读框正确完整,酶切证实LIGHT-pCI-neo中LIGHT插入方向正确.转染的293T细胞经G418筛选3个月后,流式细胞仪检测有78.69%的细胞表达人LIGHT分子.结论成功克隆LIGHT基因并获得稳定表达膜型LIGHT分子的293T细胞系.     

蛋白质组学教学方法探讨

过去蛋白质研究的根本缺陷在于孤立地研究单个蛋白质的结构、功能、表达以及与疾病的关系。但是,人体或自然界的生物并不仅仅是各种蛋白质的混合物,而是一个统一的整体。一种蛋白质的缺陷可能导致其它相关蛋白质含量的改变,或者由其它的蛋白质加以代偿。因而从单一蛋白质出发,无论是进行疾病的论断还是生物技术,都将是不全面的。     

CD4+CD25+调节性T细胞对乙肝疫苗弱/无应答者外周血单个核细胞分泌IL-4水平和抗-HBs产生的影响

摘要 目的：通过分析乙肝疫苗弱/无应答者外周血单个核细胞（PBMC）剔除CD4+CD25+调节性T细胞（简称Treg）和不剔除Treg细胞后，用乙肝表面抗原（HBsAg）诱导，检测其培养上清IL-4分泌水平和抗-HBs的产生水平，来探讨Treg细胞与乙肝疫苗弱/无应答现象的关系。方法：选择25例乙肝疫苗无应答者，30例弱应答者，同时选择20例强应答者作为对照，用HBsAg在体外诱导剔除和不剔除Treg细胞的三组人外周血PBMC，采用酶联免疫吸附法（ELASA）测定培养上清的IL-4分泌水平和抗-HBs的产生水平。结果：剔除Treg细胞的外周血PBMC经HBsAg诱导，其培养上清IL-4分泌水平强应答组、弱应答组和无应答组相比无显著差异（P>0.05），其抗-HBs的产生水平也无显著差异（P>0.05）；不剔除Treg细胞的外周血PBMC经HBsAg诱导，其培养上清IL-4分泌水平与抗-HBs的产生水平弱/无应答组与强应答组相比差异显著（P<0.01），弱/无应答组的IL-4分泌水平与抗-HBs的产生水平显著低于强应答组。结论：不剔除Treg细胞的外周血PBMC经HBsAg诱导，其培养上清IL-4分泌水平和抗-HBs的产生水平弱/无应答组与强应答组相比显著低下。由于IL-4主要是由Th2细胞分泌，因此我们推测乙肝疫苗弱/无应答现象可能是由于Treg细胞抑制了Th2细胞的极化，从而影响了机体的体液免疫应答。