IgG型抗CD55×抗β-Gal基因工程双特异性抗体的构建

目的　探讨用生物学方法治疗病毒感染性疾病及肿瘤的新途径。方法　以有重要补体活化调节功能的膜补体调节蛋白CD5 5为靶点 ,以 β GaL为模拟病毒或肿瘤抗原 ,制备“IgG”型抗CD5 5×抗 β Gal基因工程双特异性抗体 ,并对该重组抗体真核表达后的结合活性进行初步的验证。结果　克隆的CD5 5抗体可变区片段为新的小鼠抗体可变区片段 ,经HEK 2 93细胞表达后的重组抗体显示了良好的CD5 5及Fc结合活性。结论　本研究为病毒性疾病或肿瘤的免疫学治疗提供了新的途径及实验依据     

体外转录制备的siRNAs对SARS-CoV复制的抑制作用

目的体外研究针对SARS-CoV RNA依赖性RNA聚合酶（RNA-dependent RNA polymerase,RdRp）的小干扰RNA（Small interference RNA,siRNA）对SARS-CoV感染的抑制效应。方法利用Ambion公司在线设计工具,设计出4条针对RdRp基因的siRNAs,并在体外利用试剂盒进行转录合成。在SARS-CoV感染前1d,将这4条体外转录的siRNAs用Lipofectamine 2000试剂转染入Vero E6细胞中。感染后,每天观察感染细胞的细胞病变效应（Cytopathic effect,CPE）。第5天,用空斑形成实验（Plaque formation unit,PFU）检测感染细胞培养上清液中SARS-CoV滴度。结果CPE结果显示,在感染后的前4d,各siRNAs均能有效地保护细胞免受感染;在第5天,4条siRNAs中有3条仍能有效保护细胞不被感染。PFU实验结果显示,在第5天,所有siRNAs转染的细胞培养上清液中,SARS-CoV的滴度均显著低于阳性对照（P〈0．001）。结论实验结果表明针对SARS-CoV的RdRp基因的siRNAs能有效而特异地抑制该病毒在哺乳动物细胞中的复制和繁殖,提示如果应用合适的给药途径,RNAi策略可以用于体内抑制SARS-CoV的感染。     

衰变加速因子在Jurkat细胞增殖及分泌IL—2中的作用

目的 研究衰变加速因子对CD3阳性与阴性Jurkat细胞的增殖效应及对IL－2分泌的影响。方法 应用MTT比色实验观察交联DAF单抗DG3与固相化抗CD3联合作用对CD3阳性与CD3阴性Jurkat细胞增殖效应;IL－2依赖CTLL^3H-TdR掺入实验检测CD3阳性与CD3阴性Jurkat细胞IL－2的分泌;细胞ELISA检测CD3阳性与CD3阴性Jurkar细胞IL－2R的表达。结果 交联DG3可协助促进固相化抗CD3对CD3阳性Jurkat细胞的增殖效应和IL－2分泌,并可引起IL－2Rα链表达增加,此作用可被Src家族酪酸激酶抑制剂PP2所抑制,而对CD3阴性Jurkat细胞无此作用。结论 衰变加速因子可协同促进固相化抗CD3对CD3阳性Jurkat细胞的刺激增殖效应、IL－2分泌及IL－2R表达增加。     

人重组LIGHT-Fc分子的真核表达及其抗肿瘤活性研究

目的：构建人LIGHT-Fc基因的真核表达质粒，并表达获得有较高生物学活性的纯化人LIGHT-Fc融合蛋白。方法：从cDNA文库中PCR扩增LIGHT全长编码基因，并导入克隆载体。测序证实后，继续用PCR扩增其膜外区cDNA，用重叠延伸技术(SOE)引入cD137信号肽基因。将SOE产物与hlgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNA3中，瞬时转染293T细胞，用夹心ELISA检测其表达情况，经蛋白A亲和纯化，用SDS-PAGE检测其纯度与Mr，并以肿瘤细胞为靶细胞，检测其生物学活性。结果：测序证实构建的LIGHT与LIGHT-Fc cDNA阅读框完整，连接部位序列正确；ELISA和SDS-PACE证实LICHT-Fc融合蛋白的表达与纯度；MTT证明人LIGHT-Fc蛋白对一些肿瘤细胞系具有生长抑制作用。结论：获得了有抗肿瘤活性的纯化hLIGHT-Fc融合蛋白，为探讨LIGHT在免疫自稳调节中的地位、结合相应受体后的动力学与信号转导机制，以及探索LIGHT的其他生物学功能奠定了坚实的实验基础。     

利用2DE-MS技术筛选和鉴定大肠癌血清标志物

目的 利用2DE-MS技术对大肠癌患者血清和正常人血清蛋白进行比较分析,筛选和鉴定差异蛋白.方法 收集正常人(n=10)和大肠癌患者(n=15)术前血清,进行去除白蛋白和免疫球蛋白及脱盐浓缩预处理,应用2DE-PAGE分离处理后血清蛋白,比较两者的差异蛋白质点,采用MALDI-TOF分析鉴定差异蛋白质.结果 血清经预处理后,可提高样品的上样量,2DE-PAGE图谱的蛋白质点数明显增加,水平条带明显减少.大肠癌患者血清中共筛选2个差异的蛋白点,经质谱鉴定为转甲状腺素蛋白( transthyretin,TTR)和细胞角蛋白1(cytokeratin-1,CK-1).其中TTR在大肠癌患者血清中为低表达,而CK-1为高表达.大肠癌患者血清中TTR含量为(245.87±60.72) mg/L,明显低于大肠腺瘤组和正常血清组[分别为(299.53±67.91)、(311.31±67.01) mg/L,P＜0.01].结论 2DE-MS技术是筛选和鉴定疾病血清标志物的良好工具,TTR可能是大肠癌潜在的血清标志物.     

SARS-CoV S2蛋白基因的克隆及其在Vero E6细胞中的表达

目的克隆人SARS病毒S2蛋白分子的编码序列,并在VeroE6细胞上获得表达.方法从人SARS病毒cDNA文库中用PCR技术克隆编码SARS病毒S2蛋白的片段.将它插入质粒载体PVAXl中构建重组S2-pVAXl真核表达载体,并对插入片段序列进行测序.采用脂质体法转染VeroE6细胞,用Western blotting检测SARS-CoV S2蛋白的表达情况.结果用PCR方法扩增出一个1 845bp的基因片段,并插入pVAXl载体中,成功构建出重组S2表达载体,经测序证实克隆的S2片段阅读框正确完整.将其转染的Vero E6细胞经Western Blotting检测获得一条特异性目的蛋白条带.结论成功克隆基因并获得表达S2分子的Vero E6细胞系.     

RNA干扰能有效抑制SARS相关冠状病毒复制

基于RNA干扰可抑制HIV等病毒的事实[1],本课题组构建了针对SARS病毒的、能表达小发夹结构RNA的siRNA质粒,利用RNA干扰有效抑制了该病毒的复制.     

质粒表达型siRNA对SARS-CoV复制与感染干扰的初步研究

目的构建针对SARS-CoV的特异性siRNA质粒,利用RNA干扰技术抑制该病毒复制与感染.方法根据SARS-CoV的全长基因序列,以4个不同的部位为靶点,分别设计、合成含有19 nt干扰序列的一段寡核苷酸,将两两互补的寡核苷酸经退火后所形成的序列克隆到pSilencer 3.1-H1载体中,构建表达siRNA的质粒.采用脂质体法将质粒转染Vero E6细胞,经潮霉素抗性筛选后,再对稳定表达的细胞进行细胞病变、病毒空斑形成和MTT实验,以观察干扰效应.结果对所构建的质粒分别测序,确定其含有siRNA的序列与预期的特异性干扰序列一致.用不同浓度的SARS-CoV感染转染质粒后的细胞,与阴性对照相比,其细胞病变减轻、活细胞显著增加,病毒空斑明显减少.结论利用RNA干扰能有效的抑制SARS-CoV在细胞中的复制,并对细胞有保护作用,为预防、治疗SARS提供了新的思路和方法.     

人ICOSIg的真核表达及其对MLR反应的影响

目的构建人ICOSIg基因的真核表达载体,表达并鉴定ICOSIg蛋白,初步研究其对MLR中细胞增殖以及对IL-10分泌的影响。方法从活化的人T细胞cDNA文库中以PCR方法扩增ICOS胞外区cDNA编码基因,并和人IgG1Fc基因一起装入真核表达载体pcDNAB中,采用脂质体转染COS-7细胞,G418筛选,用ELISA检测其表达情况,经蛋白A亲和纯化,用SDS-PAGE和Western blotting进行鉴定。进一步通过^3H-TdR掺入法和夹心ELSIA法探讨其对双向MLR反应中细胞增殖以及对IL-10分泌的影响。结果酶切和测序证实构建的ICOS膜外区和人IgG1Fc段基因序列正确、阅读框完整;ELISA、SDS-PAGE、Western blot验证ICOSIg的正确表达;功能实验提示ICOSIg能抑制MLR中的细胞增殖和IL-10的分泌。结论成功构建并表达了ICOSIg,而获得的ICOSIg能抑制MLR。     

衰变加速因子介导Jurkat细胞的PTK信号传递机制的实验研究

为研究衰变加速因子 (DAF )介导Jurkat细胞信号传递的机制 ,本文应用免疫印迹及化学发光技术 (ECL)发现交联DAF单抗可使CD3+ 与CD3 Jurkat细胞总蛋白酪氨酸磷酸化水平增加 ,但磷酸化水平不同。免疫共沉淀实验检测到DAF与Src家族酪氨酸激酶 (SrcPTK )可发生共沉淀反应。去污剂不溶膜复合物 (DIG )抽提与鉴定检测到DIG内有SrcPTK与DAF的特异性聚集。说明DAF对Jurkat细胞的信号传递有辅助激活效应 ,此效应可能是通过其以与膜微区相关的所联系的SrcPTK实现的