腺病毒介导的血管内皮生长因子体外转染心肌细胞的研究

目的:构建携带人血管内皮生长因子(VEGF)基因的重组腺病毒载体,并转染体外培养的心肌细胞,检测VEGF的表达.方法:将人源性的VEGF165cDNA正向插入到腺病毒载体PDC315,构建重组质粒,通过脂质体共转染293细胞,经同源重组获得携带人VEGF165基因的重组腺病毒,通过PCR扩增法鉴定所构建的腺病毒,扩增并测定滴度后,体外转染培养的心肌细胞,利用ELISA、Western印迹分析等方法检测VEGF在心肌细胞中的表达.结果:人VEGF165cDNA成功地正向插入到PDC315载体中,以重组病毒基因组DNA为模板,同时扩增出了610bp的VEGF165cDNA基因片段,证实了所构建病毒的正确性,病毒滴度为2.8×108 pfu/ml,Ad VEGF165体外转染心肌细胞3 d后,在培养细胞的上清液及细胞内检测到了VEGF的表达.结论:成功构建了表达人VEGF 165基因的腺病毒载体,体外转染心肌细胞后能够满意表达VEGF,为基因治疗心肌缺血奠定基础.     

反义VEGF 165基因关节腔注射抑制大鼠胶原性关节炎形成的病理观察

目的:观察反义血管内皮生长因子(VEGF)165基因体内转染对大鼠类风湿关节炎形成的影响.方法:Wistard大鼠30只,关节炎诱导2周后随机等分为3组,并分别给予相应处理:A组(关节腔注射100 μl生理盐水)、B组(关节腔注射100 μl空病毒载体)和C组(关节腔注射100 μl反义VEGF165重组腺病毒); 4周后处死大鼠,对关节炎的发病情况、病理评分、X线放射学评分结果进行对比研究.结果:给药4周后,C组大鼠的关节肿胀程度明显轻于A、B组; C组的病理评分低于A、B组;藏红花红染色显示C组关节软骨多糖破坏轻于A、B组.结论:腺病毒介导的反义VEGF基因转染可以有效地减轻胶原性关节炎的症状,减轻滑膜血管翳对关节软骨的破坏和病理改变.     

磁共振多技术扫描与超声心动图检测心肌活性的比较

目的: 评估磁共振多技术扫描和小剂量多巴酚丁胺负荷超声心动图(LDDSE)检测心肌活性的价值.方法: 建立猪慢性心肌缺血模型25只,分别于模型制作前和制作后1～2个月进行磁共振多技术联合应用扫描及LDDSE检查,判断心肌缺血区和坏死区的大小,并与病理结果对照评估各种方法的敏感性、特异性.结果: 共有20只动物顺利完成所有检查,静息时MRI电影扫描共有16个节段(5.00%)运动丧失,9个节段(2.81%)运动减弱;负荷后电影扫描共有16个节段(5.00%)运动丧失为坏死心肌;负荷前后室壁运动计分指数(WMSI)有统计学差异(P<0.01);心肌灌注扫描见53个节段(16.56%)缺血;心肌活性扫描见23个节段(7.19%)坏死.静息时超声心动图检查共有16个节段(5.00%)运动丧失,13个节段(4.06%)运动减弱;负荷后共有16个节段(5.00%)运动丧失为坏死心肌,1个节段(0.31%)运动减弱,负荷前后WSMI有统计学差异(P<0.01).TTC染色见24个节段(7.50%)为无红染的苍白色梗死区.以TTC染色结果为金标准,MRI活性扫描、MRI电影、LDDSE检出无活性心肌的敏感性、特异性、准确性分别为95.80%、100%、99.70%;66.70%、100%、97.50%;66.70%、100%、97.50%. 结论: MRI心脏检查可结合形态、功能及灌注多种方法检测心肌活性,清晰显示心肌梗死的位置、程度,并可对左室室壁运动进行直观显示;LDDSE可通过评价异常心肌节段的收缩功能间接判断心肌损伤及其性质,其准确性较高且方法简便,但不能直接检测心肌灌注情况和心肌梗死的透壁程度.     

深低温停循环经右锁骨下动脉持续脑灌注的实验研究

目的:研究深低温停循环(DHCA)时经右锁骨下动脉持续脑灌注对脑组织的保护效果.方法:36只杂种猫随机分为3组(n＝12).组Ⅰ:单纯DHCA 90 min.组Ⅱ:DHCA 经上腔静脉逆行脑灌注90 min.组Ⅲ:DHCA 经右锁骨下动脉脑灌注90 min.检测各组脑组织超微结构变化及颈静脉血氧饱和度、颈静脉血乳酸含量、脑组织ATP含量.结果:复温后组Ⅰ颈静脉血氧饱和度为(61.7±7.0)%,低于组Ⅱ(69.0±6.1)%和组Ⅲ(71.2±5.5)%(P<0.05).光镜、电镜下组Ⅱ和组Ⅲ脑组织缺血、缺氧改变均显著轻于组Ⅰ,且组Ⅲ优于组Ⅱ.复温开始和复温完全后组Ⅱ乳酸含量为(7.36±0.44) mmol/L及(7.24±0.38) mmol/L;组Ⅲ为(6.88±0.30) mmol/L及(7.02±0.27) mmol/L,均低于组Ⅰ的(11.88±0.58) mmol/L及(11.59±0.57) mmol/L(P<0.01).复温后,组Ⅱ、组ⅢATP含量分别为(1.72±0.21) μmol/g、(2.02±0.19)μmol/g,均高于组Ⅰ的(1.08±0.24) μmol/g(P<0.01),且组Ⅲ高于组Ⅱ(P<0.05).结论:深低温停循环经右锁骨下动脉持续脑灌注更有利于脑组织的氧供需平衡,可以避免严重的脑缺血性损伤和保持满意的脑能量代谢水平.     

心肌细胞连接蛋白与心房颤动的关系

缝隙连接(gap junction,GJ)是含有多种细胞间通道的特殊膜结构,由连接蛋白(connexin,Cx)所构成,Cx40含量和分布的改变,可导致心房肌细胞电耦联传导速度改变,增加折返性心律失常,从而产生心房颤动(atrial fibrillation).本文对连接蛋白与心房颤动之间关系的研究进展作一综述.     

基因芯片技术分析同种异基因大鼠心脏移植急性排斥反应的相关基因

目的:运用基因芯片技术分析同种异基因大鼠心脏移植后急性排斥反应的基因表达谱. 方法:建立大鼠颈部心脏移植模型,以同种同基因和异基因移植动物作为对照,术后5 d移植心脏中抽提总RNA,纯化后的mRNA进行逆转录制备杂交探针,应用含有4 096个靶基因的表达谱芯片对两组移植心脏组织进行差异表达谱分析.结果:在同种异基因心脏移植术后差异表达基因共有210条(下调96条,上调114条);其中已知基因有33条(下调13条,上调20条);未知基因177条(下调83条,上调94条),其中有15条已知基因(上调2条,下调13条)尚未见报道.结论:运用基因芯片技术研究同种异基因心脏移植术后急性排斥相关基因,可为进一步研究其发病机制和治疗提供新思路.     

组织工程心脏瓣膜内皮细胞的整合素β1表达

目的体外构建组织工程心脏瓣膜（TEHV）,初步探讨内皮细胞黏附生长的分子机制。方法猪主动脉瓣膜经胰酶-EDTA、表面活性剂、核酸酶处理,去除猪主动脉瓣叶的细胞成分,测定瓣叶脱细胞后的生物力学特性;将扩增的人脐静脉血管内皮细胞（HUVECs）种植在瓣叶上,体外静态构建TEHV,观察内皮细胞的生长状态。消化瓣膜内皮细胞,半定量RT-PCR检测内皮细胞整合素＆mRNA的表达,Western-Blot检测内皮细胞膜上整合素＆蛋白的表达。结果猪主动脉瓣膜中的细胞成分能完全去除,脱细胞瓣叶的生物力学特性同新鲜瓣叶相比无明显变化;种植的HUVECs在瓣叶表面生长状态良好,长成一层连续的细胞层。瓣膜内皮细胞可检测到整合素岛mRNA和蛋白的表达。结论脱细胞猪主动脉瓣膜作为支架,HUVECs做种子细胞可以成功构建TEHV,瓣膜内皮细胞可以表达整合素岛。     

人血管内皮生长因子B的重组腺病毒制备与鉴定

血管内皮生长因子Ｂ(ＶＥＧＦ Ｂ)是一种近年来发现的血管内皮生长因子家族的新成员 ,结构与ＶＥＧＦ较为相似 ,能竞争性地与ＶＥＧＦ的受体之一ＶＥＧＦＲ 1结合〔1〕。研究表明 ,尽管ＶＥＧＦ Ｂ广泛存在于多种组织 ,但以心肌和骨骼肌为主。在胎儿发育期及缺血缺氧条件下 ,ＶＥＧＦ Ｂ在心肌中的表达量显著升高〔2〕。笔者认为 ,ＶＥＧＦ Ｂ可能对心肌缺血区的血管再生起着积极的促进作用 ,而该方面的研究国内外均未见报道。本研究在获取人ＶＥＧＦ Ｂ( 186)基因的基础上构建成ＶＥＧＦ Ｂ腺病毒重组粘粒 ,为研究其在心肌缺血区基因转染后…     

yrdC靶向RNA干扰抑制BGC-823细胞裸鼠体内成瘤的实验研究

目的检测胃癌组织及癌旁正常组织中的yrdC的mRNA、蛋白表达。构建表达yrdC靶向RNA干扰的重组腺病毒,转染人胃癌细胞株BGC-823,检测干扰后BGC-823细胞yrdC蛋白水平变化,转染后细胞移植裸鼠体内成瘤,观察yrdC沉默后移植瘤生长的变化。方法采用逆转录-聚合酶链反应（RT-PCR）和Western blot法,检测7例胃癌组织及癌旁正常组织中的yrdC的mRNA、蛋白表达。构建表达针对人yrdC的si RNA的重组腺病毒,重组腺病毒Ad-shyrdC转染BGC-823细胞,Western blot检测干扰后BGC-823细胞yrdC蛋白水平变化。裸鼠分3组,分别皮下移植转染Ad-shyrdC、空病毒Ad-Null及未转染的BGC-823细胞（1&#215;107/只）,5周后检测裸鼠肿瘤的体积及质量,肿瘤HE染色及yrdC、PCNA、TUNEL免疫组化染色,观察各组yrdC蛋白表达、细胞增殖能力及细胞凋亡的变化。结果胃癌组织中yrdC mRNA及蛋白表达量均比癌旁组织增高。成功构建表达抑制yrdC基因的重组腺病毒Ad-shyrdC,腺病毒介导的yrdC靶向RNA干扰能特异性抑制BGC-823中yrdC蛋白的表达,Ad-shyrdC组肿瘤细胞yrdC蛋白水平明显下降。转染BGC-823细胞后移植裸鼠体内,5周后成瘤体积及质量较Ad-Null组及PBS对照组明显减小（P〈0.05）;yrdC蛋白表达减少,PCNA染色提示肿瘤细胞增殖活性受抑,TUNEL染色显示凋亡明显增多（P〈0.01）。结论腺病毒介导的RNA干扰能有效抑制BGC-823细胞裸鼠体内成瘤,yrdC基因有可能成为胃癌基因治疗的靶点。     

重组腺病毒转染兔心肌细胞的实验研究

目的:观察腺病毒载体转染兔心肌细胞的有效性和外源性基因表达的时相性.方法:用Adv5-CAG粘粒(对照组)或Adv5-CAG/LacZ质粒(治疗组)转染兔心肌,转染后第3、7、14、28天取被转染心肌组织行X-gal染色及β-半乳糖苷酶活性检测.结果:X-gal染色示,治疗组转染后第3、7、14、28天注射部位心肌均见蓝染,尤以第7、14天明显,而对照组所有心肌均无蓝染;β-半乳糖苷酶活性检查示治疗组转染后第3天心肌中即有β-半乳糖苷酶表达,第7、14天表达达高峰,28天表达量明显减少.结论:重组腺病毒载体可成功转染兔心肌细胞,外源性基因在兔心肌细胞中能有效地表达并能维持1个月左右.