猪脱细胞主动脉瓣叶不同方法预处理后种植内皮细胞的比较研究

目的:猪脱细胞主动脉瓣叶经不同的方法预处理后,种植新生牛主动脉内皮细胞(BAECs),观察细胞的增殖状态。方法:猪脱细胞主动脉瓣叶分别经纤维连接蛋白(Fn,50 μg/ml)预铺、胎牛血清(FCS)浸泡、无血清DMEM浸泡预处理12 h,采用间隔24 h、3次种植的方法种植 BAECs,于种植后第4天、第7天进行细胞计数,并行MTT法和~3H-TdR掺入量检测比较细胞的增殖状态。同时于第7天取瓣叶进行组织学检测,观察瓣叶表面内皮细胞覆盖情况。结果:种植后第4天和第7天,采用Fn预铺、FCS浸泡预处理的脱细胞瓣叶,其细胞计数、MTT的光密度和~3H-TdR掺入值明显高于无血清DMEM预处理组(P<0.01)。瓣叶经H-E染色,可见Fn预铺、FCS浸泡预处理组内皮细胞的覆盖情况优于无血清DMEM浸泡组。结论:Fn或FCS预处理能明显增加内皮细胞在脱细胞瓣叶表面的黏附和增殖,有利于组织工程心脏瓣膜的体外构建。     

可降解外套管减轻自体移植静脉内膜增生的动物模型建立

目的建立可降解外套管束缚自体移植静脉减轻静脉内膜增生的动物模型,探讨可降解材料做外套管对防止或延缓桥静脉再狭窄的可行性.方法以"no-touh"方法取犬股静脉,调转后移植到同侧股动脉,其中一侧加用聚乳酸-聚乙醇酸(PLGA)做成的圆柱形外套管(外套管组),另一侧单纯静脉移植(对照组).超声多普勒观察移植静脉是否通畅.术后4周和24周再次手术取移植静脉段.病理切片行苏木素-伊红hE)染色测量移植静脉中段内膜、中层厚度;维多利亚蓝(VB)染色观察胶原纤维、弹力纤维;免疫组织化学平滑肌α-actin抗体染色鉴定静脉平滑肌.结果(1)所有动静脉吻合口无狭窄,术后早期,外套管组2条静脉血栓形成、闭塞,对照组1条静脉血栓形成、闭塞;(2)外套管变化术后4周内外套管无变形,6周开始变形,24周完全降解;(3)静脉内膜和中层厚度外套管组静脉内膜增生轻,厚度均匀,对照组静脉内膜不均匀增厚,术后4周和24周外套管组静脉中段的内膜及中层厚度均显著小于对照组,差异有非常显著性 (P< 0.01); (4)移植静脉新生内膜主要由平滑肌细胞(SMCs)和胶原纤维构成,术后4周和24周对照组两者含量丰富,而外套管组含量少于对照组且排列整齐.结论该动物模型设计合理,PLGA可以做移植静脉的外套管材料,外套管降解前后均可明显减轻移植静脉内膜和中层增生,减少平滑肌细胞和胶原纤维在内膜沉积.     

人血管形成素腺病毒重组粘粒构建

血管形成素(angiopoietin,ANG)是一种新近发现的与血管生长密切相关的生物因子,目前已发现有两种分型,即和型血管形成素(ANG,ANG2)[1,2]。其中型血管形成素具有很强的促进血管内皮细胞增殖和血管形成的作用[3],其编码基因位于染色体的8q22.3-q23区,受体为Tie-2。体内外实?..     

表达大鼠caspase-3 siRNA腺病毒的构建及其对神经元凋亡的影响

目的 构建表达大鼠caspase-3 siRNA腺病毒,体外观察其抑制内毒素诱导神经元凋亡的效果.方法 合成正、反义寡核苷酸并克隆入pShuttleH1载体,与含caspase-3及绿色荧光增强蛋白序列的质粒pEGFPC1-Cas3共转染293细胞,流式细胞仪分析荧光强度;pShuttleH1-siCas3线性化后转化到含pAdEasy-1的BJ5183感受态细菌中获取重组质粒,脂质体转染293细胞获取重组腺病毒Ad-siCas3;TCIDs.法测定病毒滴度;感染海马神经元,观察内毒素诱导神经元caspase-3 mRNA的表达及凋亡情况.结果 目的基因序列正确,pShuttleH1-siCas3可明显减弱pEGFPC1-Cas3绿色荧光,Ad-siCas3滴度为1.06×1010 pfu/ml.转染病毒的海马神经元内毒素诱导的凋亡效应及caspase-3 RNA的表达明显减弱.结论 成功地构建了表达大鼠caspase-3 siRNA腺病毒,具有良好的抑制神经元凋亡作用.     

窦房结细胞自体移植治疗完全性房室传导阻滞

目的 探索窦房结细胞自体移植到右室前壁心肌内,治疗心脏术后完全性房室传导阻滞的可行性.方法 取健康杂种犬20只,随机分为移植组和对照组,每组10只.安置电子心脏起搏器后,获取移植组犬窦房结组织并制成细胞悬液,经荧光标记后注射到移植组自体右心室前壁心肌内.对照组窦房结行Van Gieson染色,并与心耳肌组织比较.对照组右心室相同部位注射等量培养液.两周后射频消融希氏束,建立完全性房室传导阻滞动物模型,并进行心脏电生理研究.对移植组犬经股静脉应用异丙肾上腺素,研究心律变化.结果 急性分离的成年犬窦房结细胞多为长梭形,细胞活性好.获取的窦房结组织行Van Gieson染色后可见其典型结构特征.建立完全性房室传导阻滞犬模型1 h后,移植组心率高于对照组(P＜0.05),且此室性自主心律起源于细胞移植部位.注射异丙肾上腺素后,移植心室律变化明显(P＜0.05).结论 成年犬窦房结细胞移植到自体右室前壁心肌内,能够提高完全性房室传导阻滞后的心室律,并对异丙肾上腺素具有良好的反应性.     

动态三维超声心动图评价基因转染骨髓基质细胞移植治疗慢性缺血心肌实验研究

目的评价动态三维超声心动图(DTDE)对基因转染骨髓基质细胞(BMSCs)移植治疗慢性缺血心肌研究价值.方法在猪冠脉左旋支放置Ameroid环建立慢性心肌缺血模型;4周后分组注射编码血管生长素(ANG)基因腺病毒(Ad)转染的自体BMSCs(Ⅰ组)、编码ANG基因的Ad(Ⅱ组)、单纯BMSCs(Ⅲ组)和空Ad磷酸盐缓冲液(Ⅳ组).再4周后行病理学检查.分别于正常状态、置环后4周和注射后4周开胸时采集二维图像,应用TomTec 4D cardio-view软件进行三维重建和分析,观测各时期左室形态、侧后壁(LPW)回声和运动、左室舒张和收缩末期容积(LVEDV, LVESV)和射血分数(LVEF)变化.结果慢性心肌缺血模型均出现左室重构和LPW室壁运动减弱、回声增强,LEDV明显增大,LVEF明显降低(P＜0.01).注射后4周, Ⅰ～Ⅲ组均不同程度出现左室重构现象减轻,LVEDV缩小(P＜0.05),LVEF增大(P＜0.05),其中以Ⅰ组治疗效果最好,侧后壁室壁回声减弱,运动增强(P＜0.05).Ⅳ组与缺血时无明显差异(P＞0.05).结论 DTDE对评价基因转染细胞移植治疗慢性缺血心肌具有重要应用价值.     

沉默血管生成素-2表达对人肺腺癌细胞生物学特性的影响

背景与目的促血管生成素-2(Ang-2)是一类调节血管生成的重要细胞因子,与肿瘤的发生发展有密切的联系.本研究通过腺相关病毒(adeno-associated virus,AAV)介导的RNA干扰(RNAinterference,RNAi)抑制肺腺癌细胞A549Ang-2的表达,观察其对癌细胞生物学特性的影响.方法构建H1启动子驱动的表达针对Ang-2的小干扰RNA(siRNA)重组腺相关病毒(AAV-Ang-2shRNA),转染A549细胞,同时以正常A549细胞及其转染空病毒(AAV-Null)的A549细胞作为对照,观察RNAi沉默Ang-2表达在体外及体内对A549细胞生长、致瘤、增殖、凋亡及肿瘤微血管密度的影响.结果体外实验结果表明重组腺相关病毒转染A549细胞48 h后Ang-2蛋白表达比对照组明显降低(P＜0.001);细胞生长明显减慢(P＜0.001).RNA干扰后A549细胞细胞周期分析结果提示A549细胞对照组、AAV-Null对照组和AAV-Ang-2thRNA验组的增殖指数(proliferation index,PI)分别为0.51±0.43、0.48±0.29和0.26±0.31.AAV-Ang-2shRNA验组与对照组比较,PI明显减少(P=0.001).体内实验结果表明,AAV-Ang-2shRNA实验组在胸腺缺陷小鼠成瘤体积、瘤质量均明显低于两对照组(P＜0.01).各组微血管密度分析结果分别为46.4+13.1、44.2+13.6和34.9±12.8;AAV-Ang-2shRNA实验组肿瘤组织内新生血管数目明显低于对照组(P＜0.001).各组凋亡指数(apoptosisindex,AI)分别为(5.98±3.11)％、(7.51±4.42)％及(17.06±7.43)％.AAV-Ang-2shRNA组比PBS组、AAV-Null组凋亡百分率明显增高(P=0.005,P=0.007).各组细胞增殖核抗原(proliferating cell nuclear antigen,PCNA)阳性表达率分别为(92.75+9.7)％、(85.8±11.8)％、(69.8+16.5)％;AAV-Ang-2shRNA组PCNA指数低于两对照组(P=0.014,P=0.021).结论腺相关病毒介导的siRNA表达能明显抑制A549细胞中Ang-2的表达,减慢肿瘤细胞的增殖,促进肿瘤细胞凋亡,抑制肿瘤生长.     

人食管鳞癌细胞的体外培养及生物学性状

目的研究人食管鳞癌细胞的体外培养及生物学性状。方法自原发食管鳞癌组织中获取标本,应用消化培养法培养出可连续传代的肿瘤细胞,对培养的细胞进行形态学观察、免疫组织化学鉴定;MTT法测定细胞数,绘制生长曲线和计算细胞倍增时间,平板克隆实验以测定平板克隆形成率、流式细胞仪测定细胞周期分布。结果30例患者的肿瘤组织有6例成功体外培养出肿瘤细胞,培养出的细胞符合鳞癌特性;细胞生长具有平台期,细胞倍增时间（33．12±6．10）h,平板克隆形成率（15．73±4．46）％;（77．57土6．57）％细胞处于细胞增殖的G0、G1期,少数细胞处于活跃的增殖期。结论人食管鳞癌细胞成功获得了体外培养;肿瘤细胞的增殖能力不同,只有少数细胞增殖活跃。     

腺病毒介导的VEGF-B基因促血管内皮细胞增殖作用的研究

为观察腺癌毒素介导的血管内皮细胞生长因子B（VEGF－B）基因体外转染对血管内皮细胞的促增殖作用，构建编码人VEGF－B基因的复制缺陷的重组腺病毒载体，体外转染鼠主动脉血管内皮细胞（RAECs），应用RT－PCR和Western blot检测外源VEGF－B的表达，应用四唑盐（MTT）观察转染后RAECs的增殖。结果发现，RAECs可有效地被重组腺病毒载体感染，并能成功转录和表达VEGF－B基因和蛋白，在转染后细胞培养上清中检测到VEGF－B蛋白的表达，对RAECs有显著促增殖作用。提示重组腺病毒载体介导的人VEGF－B基因有血管新生作用，可用于缺血性心脏病的治疗。     

可降解外套管对自体移植静脉基质金属蛋白酶-2,9表达的影响

基质金属蛋白酶（MMP）-2和-9与平滑肌细胞（SMC）的增殖和迁移关系密切。本研究旨在观察可降解材料聚乳酸．聚乙醇酸（PLGA）外套管降解前后对自体移植静脉（AVG）内膜和MMP-2和-9表达的影响，探讨可降解外套管减轻AVG内膜增生的生物学机制。