MicroRNA-150对NK/T细胞淋巴瘤组织和NK-92细胞辐射敏感性的影响

目的:探讨microRNA-150 (miR-150)对NK/T细胞淋巴瘤组织和NK-92细胞辐射敏感性的影响.方法:选取2010年1月至2016年1月在南方医科大学珠江医院收治的NK/T细胞淋巴瘤患者36例为研究对象,并收集患者的组织标本.所有患者均接受放疗并采用淋巴瘤国际工作组标准((IWG)评价患者的近期疗效,根据疗效分为完全缓解(CR)组和未完全缓解组(Non-CR).实时荧光定量PCR检测患者肿瘤组织及NK/T细胞淋巴瘤细胞系中miR-150的表达量,向淋巴瘤NK-92细胞转染miR-150 mimics,利用MTT法和集落形成实验分析过表达miR-150对NK-92细胞辐射敏感性的影响,流式细胞术检测转染过表达miR-150对NK-92细胞辐射致凋亡的影响,Western blotting实验检测miR-150对凋亡相关蛋白Caspase3和PARP表达的影响.结果:根据IWG标准,12例患者CR,24例患者为Non-CR;与CR组相比,Non-CR组患者miR-150表达量普遍下调(P＜0.05).与正常对照sCD3-CD56+ NK细胞相比,NK/T细胞淋巴瘤组织(9.10±0.19 vs4.01±0.22,P＜0.01)和5种NK/T细胞淋巴瘤细胞系中miR-150呈明显低表达(P＜0.05).过表达miR-150可明显降低辐射后NK-92细胞的增殖能力(P＜0.01)和集落形成能力(P＜0.01),明显提高NK-92细胞的辐射增敏比(10 Gy时辐增敏比为5.375),显著促进辐射诱导的NK-92细胞的凋亡[(37.3±1.24)％vs(28.3±2.34)％,P＜0.05],可促进激活的Caspase 3和PARP蛋白表达.结论:miR-150在NK/T细胞淋巴瘤组织标本及体外培养细胞系中的表达呈显著低水平,miR-150表达量低的患者放疗后缓解率低;转染miR-150 mimics能够增强辐射对NK-92细胞增殖的抑制作用和促进辐射诱导致凋亡作用,对NK/T细胞淋巴瘤有辐射增敏作用.     

中华眼镜蛇毒组分诱导人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞凋亡的研究

目的:探讨中华眼镜蛇毒组分(naja naja actra venom component,NNAVC)诱导KG1a细胞凋亡及相关机制.方法:以NNAVC作用人急性髓系白血病细胞株KG1a细胞,台盼蓝拒染法测定细胞毒性,流式细胞仪测细胞凋亡率,RT-PCR测细胞凋亡相关基因(Bax、Bak、Bcl-2)的表达.结果:NNAVC对KG1a细胞有显著的细胞毒性作用,能诱导KG1a细胞凋亡,促凋亡作用可能与Bcl-2表达下调和Bax表达上调有关.结论:NNAVC通过调节抗/促凋亡分子诱导KG1a细胞凋亡,提示NNAVC具有治疗复发难治性白血病的应用前景.     

肿瘤生物治疗的新模式:分子靶向-过继性细胞免疫治疗

分子靶向－过继性细胞免疫治疗是分子靶向药物和过继性细胞免疫疗法有机结合的新治疗模式,该模式建立在NK细胞活化性信号通路(NKG2DNKG2DLs) 的生物学特性,尤其是受配体可调控性的理论基础之上。分子靶向药物在其中扮演双重角色,除了药物本身对肿瘤细胞的毒性作用外,还作为“刺激诱导”源,诱导肿瘤细胞表达免疫激活物NKG2DLs（natural killer group 2 member D ligands）,与NK细胞表面NKG2D（natural killer group 2 member D）结合,激活NK细胞的杀伤活性。NKG2D与NKG2DLs是NK细胞主要的活化性受、配体,在机体抗肿瘤免疫中起重要作用。NKG2D主要表达于NK、CD8+T、γδT和活化的巨噬细胞,参与适应性及固有性免疫应答。与NKG2D结合的配体(NKG2DLs)广泛低表达于多种肿瘤细胞,而在正常组织细胞几乎未见表达,靶细胞的NKG2DLs表达水平直接关系到免疫效应细胞（NK、DC、CTL细胞等）对其的杀伤活性。NKG2DLs的转录与表达可受多种因素影响,分子靶向药物可以诱导肿瘤细胞高表达NKG2DLs,NK细胞对高表达NKG2DLs的肿瘤细胞有较高杀伤活性,而对正常组织无杀伤作用,具有杀伤靶向性;NKG2DLs的高表达也增强了肿瘤细胞对其他免疫效应细胞的杀伤敏感性,具有良好的应用前景。分子靶向药物联合过继性细胞免疫治疗将使肿瘤患者获得更好的临床疗效,预示了肿瘤生物治疗新的发展方向——分子靶向-过继性细胞免疫治疗新模式的来临。     

舒尼替尼体内诱导耐药鼻咽癌细胞表达NKG2DLs增强NK细胞的抑瘤作用

目的：探讨体内条件下舒尼替尼对耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞NKG2DLs（natural killer group 2 member D ligands)表达的诱导作用,及其对NK细胞抗肿瘤活性的影响。方法：建立ABCG2highCNE2/DDP和ABCG2lowCNE2/DDP细胞裸鼠皮下移植瘤模型,分如下8组：A、E组分别接种ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞,B、F组分别接种舒尼替尼处理的ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞,C、G组分别接种ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞后再输注NK细胞;D、H组接种舒尼替尼处理的ABCG2high、ABCG2lowCNE2/DDP细胞后再输注NK细胞。检测各组裸鼠成瘤时间、成瘤率、肿瘤体积和抑瘤率。免疫组织化学法检测移植瘤组织中NKG2DLs的表达。结果：A、B、C、D和E、F、G、H组肿瘤出现时间分别为(5.43±1.00)、(8.50±035)、(1110±1.25)、(13.56±1.23) d和 (9.00±1.00)、(12.30±0.78)、(14.50±0.50)、(17.25±0.77) d,其中舒尼替尼与NK细胞联合处理组（D 和H 组）成瘤时间最晚（P<0.01）。A、B、C、D和E、F、G、H组肿瘤质量分别为(2.63±089)、(1.00±003)、(065±0.08)、(0.21±0.27) g和(2.79±0.83)、(1.18±0.77)、(0.96±0.50)、(0.86±0.82) g,其中舒尼替尼与NK细胞联合处理组肿瘤质量最小（P<001）;舒尼替尼与NK细胞联合处理的D组和H组的抑瘤率分别为92%和69%。舒尼替尼上调移植瘤组织中NKG2DLs的表达,且ABCG2highCNE2/DDP细胞移植瘤中的NKG2DLs表达率高于ABCG2lowCNE2/DDP细胞。结论：舒尼替尼可在体内诱导CNE2/DDP移植瘤组织表达NKG2DLs,增强NK细胞的抗肿瘤作用。     

索拉非尼对高表达三磷酸腺苷结合转运蛋白G超家族成员2的鼻咽癌细胞杀伤敏感性的影响的研究

目的 探讨索托非尼提高高表达三磷酸腺苷(ATP)结合转运蛋白G超家族成员2(ABCG2)的人耐药鼻咽癌CNE2/DDP细胞(简写作ABCG2High细胞)对同种异体反应性自然杀伤Allo-NK)细胞的杀伤敏感性及其相关机制.方法 利用免疫磁珠技术分离ABCG2HighCNE2/DDP和Allo-NK细胞,并设3个实验组:①处理组(经索拉非尼10ng/ml共孵育4h的ABCG2HighCNE2/DDP细胞);②未处理组(常规培养的ABCG2HighCNE2/DDP细胞);③对照组(常规培养的K562细胞).流式细胞技术检测处理组和未处理组细胞的ABCG2表达率和5种NKG2D配体(MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3)的表达率.乳酸脱氢酶(LDH)释放测定法检测Allo-NK细胞对各实验组细胞的杀伤率.结果 分离后的CNE2/DDP细胞的ABCG2表达率为91.40%±2.32%,分选出的CD3-CDl6+CD56+ (Allo-NK)细胞纯度大于90%.未处理组的ABCG2 HighCNE2/DDP细胞的NKG2D配体MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达率分别为2.92%±0.33%、4.27%±0.33%、5.80%±0.62%、11.10%±3.15% 、7.75%±1.14%,而处理组明显升高(分别为10.38%±1.23%、10.68%±1.26%、11.62%±1.22%、43.24%±4.42%、11.91%±0.88%;P<0.05).在效靶比为10:1、20:1时,Allo-NK细胞对未处理组靶细胞的杀伤率为15.32%±1.34%、27.26%±6.81%,而对处理组靶细胞杀伤率为27.75%±4.12%、43.17%±5.92%,两组相比差异有统计学意义(P<0.01).结论 索托非尼通过诱导肿瘤细胞高表达NKG2D配体,使其对AIIo-NK细胞的杀伤敏感性增强.     

苦参碱通过诱导NKG2D配体高表达增强NK细胞对ABCG2high耐药鼻咽癌细胞杀伤活性

目的 探讨苦参碱提高ABCG_2~(High)[三磷酸腺苷(ATP)结合转运蛋白G超家族成员2]耐药鼻咽癌细胞对Allo-NK细胞杀伤敏感性的机制.方法 利用免疫磁珠技术分离ABCG_2~(High)CNE2/DDP细胞及Allo-NK细胞,流式细胞技术检测分离后细胞纯度及经苦参碱处理前后靶细胞NKG2D配体表达率,LDH释放测定法检测经苦参碱处理前后ABCG_2~(High)CNE2/DDP细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性.结果 ABCG_2~(High)CNE2/DDP细胞分离后ABCG_2表达率为(91.40±2.32)%,分选后NK细胞CD3~-CD16~+CD56~+细胞的纯度达90%以上,经苦参碱处理之后靶细胞MICA、MICB、ULBP1、ULBP2、ULBP3表达率,由药物处理之前的(2.92±0.33)%、(4.27±0.33)%、(5.80±0.62)%、(11.10±3.15)%、(7.75±1.14)%分别上升到(11.30±0.89)%、(14.29±2.61)%、(12.56±1.06)%、(43.24±4.43)%、(12.77±1.06)%.在效靶比为10:1、20:1,Allo-NK细胞对苦参碱处理前后ABCG2HighCNE2/DDP细胞的杀伤率分别为(15.32±1.34)%、(27.26±6.81)%及(28.53±1.37)%、(42.72±2.80)%.处理前后杀伤率有显著性差异(F=29.05,P=0.000).结论 苦参碱通过诱导肿瘤细胞高表达NKG2D配体(MICA/B、ULBP1-3),使肿瘤细胞对Allo-NK细胞的杀伤敏感性增强.

Abstract：

Objective To investigate the mechanism underlying the effects of matrine in enhancing the cytotoxic sensitivity of CNE2/DDP cells highly expressing ATP-binding cassette superfamily G member 2(ABCG_2~(High) to allogenic natural killer (Allo-NK、cells.Methods ABCGr2~(High) CNE2/DDP cells and Allo-NK cells were isolated by magnetic activated eell sorting (MACS).Flow cytometry was used to evaluffte the purity of the isolated cells and the expression of NKG2D ligands on thetarget cells before and after incubation with matrine.The cytotoxic sensitivity of the treated and non.treated ABCG_2~(High)CNE2/DDP cells to Allo-NK cells was measured by LDH releasing assay. Resuits The expression rate of ABCG2 was (9 1.40±.-321%in ABCG_2~(High),CNE2/DDP cells. More than 90% of the isolated NK cells were identified to be CD3~-cD16~+CD56~+ cells.The expression rates of MICA,MICB,ULBP1,ULBP2,and ULBP3 on the target cells incubated with matrine increased from(2.92±0.33)%,(4.27±0.33)%,(5.80±0.62)%,(11.10±3.15)%,and(7.75±1.14)% to(11.30±0.89)%,(14.29±2.61)%,(12.56±1.06)%,(43.24±4.43)%,and(12.77±1.06)%,respectively.At the E:T ratio of 10:1 and 20:1,the cytotoxic sensitivity of ABCG2High cells to Allo-NK cells increased from(15.32±1.34)% and (27.26±6.81)% in un-treated cells to(28.53±1.37)% and(42.72±2.80)%in matrine-treated cells,respectively,showing significant differences in the cytotoxic sensitivity of the target cells in both groups produced by matrine treatment(F=29.05,P=0.000).Conclusion Matrine can up-regulate the expressions of NKG2D ligands (MICA/B and ULBP 1-3)in ABCG_2~(high) nasopharyngeal carcinoma cells,which results in increased cytotoxic sensitivity of the cells to Allo-NK cells.     

舒尼替尼促进人肝癌细胞HepG2的凋亡及其分子机制

目的：探讨苹果酸舒尼替尼对人肝癌HepG2细胞凋亡的作用及其机制。方法：常规体外培养HepG2细胞,利用MTT法检测舒尼替尼杀伤HepG2细胞的IC50,Western blotting 检测药物处理前后HepG2细胞分子靶点蛋白表达,膜联蛋白(Annexin-V)/碘化丙啶(PI)双标法和TUNEL染色法检测舒尼替尼处理前后HepG2细胞凋亡情况,实时荧光定量PCR检测药物处理前后HepG2细胞凋亡基因 mRNA的表达情况。结果：舒尼替尼杀伤HepG2细胞的IC50值为（3.22±0.50）μmol/L。以对HepG2细胞无明显抑制作用的剂量1 μmol/L舒尼替尼处理HepG2细胞后,细胞内VEGFR1、VEGFR2、PDGFRα、Kit、FLT3蛋白表达均有不同水平下降（均P<0.05）,HepG2细胞的凋亡率\[(15.18±1.28)% vs (5.90±0.45)%,P<0.05\]、凋亡指数（AI）\[(23.54±4.73) vs (4.17±0.64), P<0.05\]均显著升高。舒尼替尼处理HepG2细胞后,上调促凋亡基因Bax、NOXA、PUMA、P53 mRNA表达水平（均P<0.05),降低抑凋亡基因Bcl-2、X-IAP mRNA表达水平（均P<0.05）。结论： 舒尼替尼能够诱导肝癌HepG2细胞凋亡,其机制可能是通过上调促凋亡基因的表达及降低抑凋亡基因表达水平来实现的。