人CD3ζRNAi逆转录病毒载体的构建及鉴定

目的:利用RNAi表达载体法构建并筛选携带针对CD3ζ基因的pSUPER retro RNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞克隆。方法:利用DNA重组技术,设计3条60 bp能转录产生靶向CD3ζ小发卡RNA(shRNA)的寡核苷酸序列,以pSUPER.retro.neo+gfp质粒作为空载体经限制性核酸内切酶酶切后与RNAi序列进行重组,构建CD3ζ-pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体,脂质体法转染包装细胞系PA317,建立产生逆转录病毒的细胞克隆。结果:重组载体经限制性核酸内切酶酶切、PCR和测序鉴定表明CD3ζ-pSUPER retroRNAi重组质粒构建成功;脂质体法将重组载体转染包装细胞系PA317,表达绿色荧光蛋白,表明包装成功。结论:成功地构建了特异性沉默CD3ζ基因的pSUPER retroRNAi逆转录病毒载体及稳定产毒的细胞系,为后续研究CD59与CD3ζ在T细胞内信号转导的相互作用提供理论和实验依据。     

弓形虫依钙蛋白激酶Calpain—like基因的克隆及表达

目的克隆弓形虫RH株Calpain—like基因片段，构建原核表达载体，诱导表达Calpain-like基因重组蛋白。方法收集、纯化弓形虫RH株速殖子，提取总RNA，在设计合成的引物中引入SalI和EcoRI酶切位点。应用FIT—PCR扩增弓形虫RH株Calpain—like基因片段，插入pGEM—T载体，提取重组质粒，双酶切获得目的基因，亚克隆到原核表达质粒pET32a，重组子经双酶切、PCR和DNA序列分析鉴定，转化大肠杆菌BL21并以IPTG诱导表达。结果从弓形虫RH株速殖子eDNA中扩增出316bp的Calpain-like基因片段；含pET32a／Calpain—like的重组质粒在宿主菌经诱导后，获得与预期分子量相符的表达产物。结论成功地克隆和表达弓形虫RH株Calpain—like基因，弓形虫Calpain—like基因的克隆表达为进一步筛选弓形虫疫苗候选分子和治疗药物的靶位提供了研究基础。     

转录因子Sp1在肿瘤细胞CD59表达调控中的作用

目的:构建针对Sp1基因siRNA真核表达载体,转染前列腺癌细胞PC-3,研究反式作用因子Sp1对CD59表达的影响.方法:应用siRNA表达载体介导的RNAi技术,构建含特异性Sp1基因的重组载体pSUPER-siSp1,脂质体法转染前列腺癌细胞,G418筛选建立稳定表达转染基因的细胞株.RT-PCR和Western blot检测转染细胞中Sp1和CD59基因的表达,染料释放试验判断CD59基因抑制后对补体溶破的抵抗作用.结果:成功构建了Sp1基因siRNA真核表达载体.转染PC-3细胞可表达荧光蛋白,稳定转染的PC-3细胞CD59基因的mRNA和蛋白水平降低,染料释放实验表明CD59基因受抑制后对补体溶破的抵抗作用降低.结论:siRNA-Sp1重组载体有效地抑制了CD59的表达,降低CD59的抗补体活性,结果证明反式作用因子Sp1是CD59表达调控中重要的转录因子,为探讨CD59在肿瘤细胞中高表达的研究奠定了基础.     

长程视频脑电图在枕叶癫痫诊断及手术定位中的应用

目的：探讨长程视频脑电（V-EEG）在枕叶癫痫（OLE）手术诊断及定位中的应用。方法：27例难治性癫痫经过带蝶骨电极的长程V—EEG监测,结合磁共振成像（MRI）、发作间期正电子发射计算机断层扫描（PET）及视力视野检测结果确定癫痫起源位置为枕叶,对该27例长程V-EEG监测结果进行回顾分析,总结OLE的长程VEEG特点。结果：癫痫起源位置的EEG定位,4例位于颞枕区、4例顶枕区、1例颞顶枕区,18例单纯枕区。OLE具有较高视觉先兆出现率,本组为21例（78％）。发作间期EEG可以具有以下特征：①正常,②慢a节律或广泛θ节律,③一侧枕区脑波被抑制,④一侧或者双侧枕区存在异常电活动,⑤病灶周围脑区存在异常电活动,⑥病灶一侧半球各导联均分布有异常电活动,⑦异常电活动主要为尖波及尖慢波。OLE发作期初期（起始）EEG具有以下特征：①一侧枕区优先优势异常放电,②一侧颞枕区优先优势异常放电,③一侧顶枕区优先优势异常放电,④半球优势异常放电,⑤无侧别优势。结论：OLE具有相应的EEG及临床发作特征,蝶骨电极长程V-EEG结合影像学以及视力视野检查结果能有效诊断OLE,为准确定位提供一定可靠依据,有效指导手术治疗。     

中西医辨证治疗风湿性小舞蹈病与多发性抽动症1例临床分析

风湿性小舞蹈病是感染溶血性链球菌后引起的一种疾病,其临床表现多样,多为全身或部分肌肉无目的、不自主的快速运动,如伸舌歪嘴、挤眉弄眼、耸肩缩颈、语言障碍、细微动作不协调等,与多发性抽动症的临床表现有某些相似之处。随着抗生素,尤其是青霉素类药物在临床普遍运用,本病的临床表现多不典型,更增加了两者的鉴别难度。现举1例不典型的风湿性小舞蹈病病例以资参考。     

改良原代培养方法提高人胎盘绒毛膜间充质干细胞的产量

目的 建立获得大量P0代人胎盘绒毛膜间充质于细胞(hpcMSCs)培养方法.方法 从胎盘绒毛膜分离出hpcMSCs,经初次培养和再次培养7d后,将原培养瓶中培养基、未贴壁组织和冲洗生理盐水离心后分别进行再次培养和第3次培养.用倒置显微镜观察细胞形态,CCK-8测定细胞生长曲线,流式细胞术检测细胞表面标记,成脂、成骨诱导分化试剂盒鉴定细胞的分化潜能.结果 获得的hpcMSCs均为成纤维细胞样贴壁细胞,每例胎盘获得(25.54±3.38)×106个P0代细胞,初次培养、再次培养和第3次培养获得的细胞数分别为(11.73±2.09)×106、(11.12±1.42)×106和(2.69±0.71)×106,培养时间分别为(12.00±0.64)d、(8.87±0.63)d和(12.33±0.80)d.再次培养时间和获得细胞数同初次培养、第3次培养差异均有统计学意义(均P＜0.05),初次培养和第3次培养的时间差异无统计学意义(P＞0.05),但第3次培养有时间延迟的趋势.3次培养的每培养瓶获得细胞数分别为(1.12±0.15)×106、(2.10±0.16)×106和(1.04±0.16)×106,再次培养获得细胞数同初次培养、第3次培养差异均有统计学意义(均P＜0.05),初次培养和第3次培养获得细胞数差异无统计学意义(P＞0.05),但第3次培养有细胞数量减少的趋势.3次培养的细胞生长曲线和表面标记的表达率无差异,成骨、成脂诱导分化检测均呈阳性.结论 一份绒毛膜标本,通过3次培养,获得的P0代hpcMSCs细胞数量比初次培养翻倍,本方法可为再生医学提供足够的种子细胞.     

邻片显示胰岛β-EP、5-HTR免疫反应细胞与A、B细胞

本实验采用成年雄性Wistar大鼠,3%戊巴比妥钠腹腔麻醉,以4%多聚甲醛磷酸缓冲液灌注固定,速取胰尾,Zamboni液后固定,常规石蜡包埋,作厚3μm的连续切片。以邻片法行免疫组化PAP染色,染色分为两组:1Glu抗血清;β-EP抗血清;Ins抗血清。2Glu抗血清;5-HT独特型抗体(能识别5-HT受体即5-HTR);Ins抗血清。以甲基绿复染细胞核。结果:β-EP免疫染色细胞分布于胰岛大部分,细胞呈圆形、椭圆形或三角形,胞质内含有棕黄色颗粒,细胞着色深浅不一。邻片示Glu免疫染色细胞分布于胰岛周边,胞质内含有棕竭色颗粒,有突起伸入胰岛内部。邻片可见β-EP免…     

急性肾后性肾功能衰竭的外科治疗

目的:探讨急性肾后性肾功能衰竭的治疗方法.方法:对22例急性肾后性肾功能衰竭的患者,根据具体病情不同,分别行输尿管镜下气压弹道碎石术、经皮肾造瘘术、膀胱镜下双"J"管置入术及急诊开放手术治疗.结果:除1例双侧先天性肾盂输尿管交界处狭窄(UPJ)患者因膀胱镜下置入双"J"管效果不佳,并拒绝进一步治疗自动出院外,其余21例患者均治愈出院,肾功能于手术后5～25 d均恢复正常.结论:对急性肾后性肾功能衰竭应针对不同病因采取灵活的治疗方法;微创治疗具有创伤小、安全可靠、患者术后恢复快等优点,在治疗急性肾后性肾功能衰竭中有着重要作用.     

山东省潍坊东部地区精神分裂症1号染色体基因扫描研究

目的对精神分裂症患者及正常对照者的1号染色体进行扫描,查找精神分裂症的关联位点。方法在1号染色体上间隔10cM（厘摩）遗传距离,选择了31个微卫星遗传位点,用DNA混合池的方法对119例精神分裂症患者与119名正常对照者的DNA样本分别混合后进行基因组扫描。经卡方检验分析,对比患者组与对照组的等位基因峰型比率的差异。结果在D1S2878遗传位点患者组与对照组的等位基因频率差异有统计学意义,P〈0.01。结论山东省潍坊东部地区精神分裂症患者群体中存在与1号染色体的关联区域。     

金黄色葡萄球菌肠毒素B基因克隆、表达及其抗血清在食物中毒快速检测上的应用

目的克隆和表达金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）基因，制备金黄色葡萄球菌肠毒素B（SEB）的多克隆抗体，应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的诊断。方法用核酸扩增技术从金黄色葡萄球菌菌株中分离产生肠毒素B的标准菌株，采用高保真PCR技术从金黄色葡萄球菌野生株中扩增全长SEB，目的片段经TA克隆后DNA序列测定，重组质粒pGEM—SEB经酶切获得的SEB基因片段与真核表达载体pGEX-4T-3连接，将重组真核载体pGEX-4T-3-SEB转化人E．coli BL21（DE3）株，在0．1mmol／LIPTG诱导下，诱导SEB基因在E-coli BL21（DE3）株中表达，用谷光苷肽Sepharose4B柱分离纯化GST融合蛋白，用SDS—PAGE检测重组SEB（rSEB）的表达，重组蛋白免疫BALB／c小鼠获得抗血清，并用抗血清与天然的SEB和rSEB进行Westembolt分析。结果成功克隆了822bpSEB基因，编码272个氨基酸，在E．coli BL21（DE3）株中表达了rSEB，分离纯化的rSEB能够诱导小鼠产生IgG抗体，此抗体不仅能够与rSEB反应，而且能够与天然的SEB特异性的反应。结论重组SEB具有抗原特性，制备的特异性抗体可应用于金黄色葡萄球菌引起的食物中毒的快速诊断，将能够建立特异性强、敏感性高的金黄色葡萄球菌的诊断体系，同时也有助于对SEB在抗肿瘤机制、炎症过程中的作用等方面研究。