光敏剂漂白特性在鲜红斑痣光动力治疗中的作用

目的：监测光动力治疗过程中鲜红斑痣组织内光敏剂含量的动态变化，探讨光敏剂漂白特性在光动力疗法微血管选择机制中的作用。方法：鲜红斑痣病人34例，男性15例，女性19例，静脉注射血啉甲醚和血卟啉衍生物5mg/kg后给予铜蒸气激光照射，使用三倍频Nd:YAG激光和光学多通道分析仪（OMA）在治疗前和治疗中的多个时间点对治疗区皮肤组织进行荧光光谱检测，绘制成时间－荧光强度曲线。结果：治疗区皮肤组织中光敏剂荧光强度在激光照射开始后迅速下降，血啉甲醚荧光强度的下降速率和下降幅度均显著大于血卟啉衍生物。结论：治疗区皮肤组织中光敏剂的漂白速度明显大于光敏剂的补充扩散速度，光敏剂漂白可能是光动力疗法微血管选择效应的主要机制。     

激光共聚焦显微成像技术对亚细胞位点光动力损伤的动态观察

目的探讨应用激光共聚焦显微成像技术对光动力效应所致亚细胞位点损伤进行动态观察的可行性。方法实验分为HMME＋Rhodamine-123组、单加HMME组、单加Rhodamine-123组和单纯细胞组，后3组作为对照组。传代培养鼠肺毛细血管内皮细胞，将血卟啉单甲醚（HMME）与内皮细胞共同孵育24h后，加入细胞探针Rhodamine-123对线粒体进行染色。应用激光共聚焦显微镜并采用细胞器-细胞荧光强度比值法对HMME进行亚细胞定位，随后采集Rhodamine-123的荧光图像动态序列。结果HMME＋Rhodamine-123组的Rhodamine-123荧光图像在光照过程中逐渐发生变化：典型的线粒体形态特征逐渐消失，并伴有荧光强度下降，荧光在胞浆内趋于弥散分布，细胞核内出现Rhodamine-123的荧光；而单加Rhodamine-123组的Rhodamine-123荧光图像未发生明显变化。结论应用激光共聚焦显微成像技术能实现亚细胞水平光敏损伤位点的动态光学检测，线粒体和核膜可能是HMME介导的光动力损伤亚细胞位点。     

光敏剂亚细胞定位研究方法的应用比较

目的 探讨不同光敏剂亚细胞定位方法的应用特点。方法 应用电感耦合器材（CCD）荧光显微成像系统，选择细胞器荧光探针BODIPY标记细胞内高尔基体。分别采用直接观察法、伪彩色融合法、波形比较法、相关系数法及细胞器一细胞荧光强度比值法，对光敏剂血卟啉单甲醚（HMME）进行细胞内分布的定性与定量研究。结果 采用直接观察法比较光敏剂和细胞器探针荧光图像，发现HMME和BODIPY的荧光分布模式有相似之处，采用伪彩色融合法得到的二者融合图像，显示存在黄色的空间重叠区域。应用波形比较法发现，直线路径上所有像素在HMME荧光图像与BODIPY荧光图像中的灰度值相对空间坐标的曲线波形相似。应用相关系数法得出，各像素的HMME荧光灰度值与细胞器探针荧光灰度值之间的相关系数值为0．6024。采用细胞器一细胞荧光强度比值法发现，随着参数m的增大，即细胞器聚集程度的降低，高尔基体聚集区域的平均荧光强度比值（J1／J2）呈下降趋势，二者具有明显的相关性（P〈0．05）。结论 通过直接观察、伪彩色融合及波形比较的方法，基本可以判定HMME在高尔基体聚集区域有分布；采用相关系数法．尤其是细胞器一细胞荧光强度比值法能得到更为精确的量化结果，以弥补定性方法的不足。     

不同给药条件下光动力疗法对兔骨骼肌损伤效应的影响

目的：为探索心脏肿瘤的光动力疗法(photodynamic therapy，PDT)治疗方案，建立兔骨骼肌在体灌注模型，观察不同给药条件下PDT对兔骨骼肌损伤效应的影响。方法：实验于2004—01／06在解放军总医院激光科实验室完成，建立兔骨骼肌在体灌注模型。分组：局部灌注组，光敏剂PSD-007为120，240mg／L两种浓度；全身给药组，耳缘静脉，5mg／kg。选择632．8nm和532nm两种波长激光。照光剂量为180J／cm^2。并设单纯照光组为对照组。照后即刻及3d，数码相机采集大体观改变，光学显微镜检测组织病理变化。结果：照光后即刻各局部灌注组的肌肉组织无明显颜色改变；3d后主要为轻中度改变，呈点状、小片状坏死，其中532nm激光组的损伤程度要重于632．8nm激光组。不同浓度的光敏剂对PDT损伤程度没有显著影响。而全身给药组即刻可见照光部分红色略微加重，3d后两种波长激光照射部位均呈瓷白色凝固性坏死改变，有的周边有一圈暗红色改变，为重度损伤。照光后即刻和3d，单纯照光组的大体观或光镜下均无明显改变。结论：该模型可以模拟在体循环条件下心肌肿瘤经停跳液灌注后的PDT治疗，停搏液灌注后明显减弱PDT的疗效，缺氧可能是该模型中制约PDT效应的主要因素。     

杂合性白血病的临床特征:5例报导

杂合性白血病一词乃指有淋巴及粒细胞两者特征起源于单克隆白血病原始细胞的急性白血病。Gale及Ben-Bassat建议杂合性白血病分为“双表型”白血病及“双系”型白血病。前者指10％以上的原始细胞有淋巴及粒细胞的双重标记。后者指同时存在有淋巴细胞特征及只有粒细胞特征的不同族的原始细胞群体,但不同于有着各自克隆起源的两种截然不同白血病细胞群体的“双克隆性”白血病。“双系型”白血病应该同时或随后发生。且时间必须限于六个月内,以除外治疗诱发的白血病及“双克隆性”白血病。     

两种荧光显微成像系统亚细胞定位的对比

目的:应用高分辨率荧光显微成像系统采集细胞器探针图像,并与激光共聚焦显微成像系统进行对比。方法:实验于2003-05/2004-01在解放军总医院完成。①实验材料:鼠肺毛细血管内皮细胞株(1H11)由上海复旦张江生物公司提供;荧光探针Rhodamine-123,Lucifer Yellow,DiOC6[3],BODIPY(美国Sigma公司)。②细胞培养及荧光探针染色:细胞培养采用含体积分数为0.2胎牛血清的低糖DMEM培养基,密度5×107L-1。选择Rhodamine-123作为细胞线粒体特异性荧光探针,选择DiOC6[3]作为细胞内质网特异性荧光探针,选择BODIPY作为细胞高尔基体特异性荧光探针,选择Lucifer Yellow作为细胞溶酶体探针。前3个探针在完全避光条件下与培养的细胞共同孵育0.5h,后者则共同孵育15h。③高分辨率荧光成像系统的图像采集:线粒体荧光图像采集,选取经Rhodamine-123共孵育完成的细胞,选择激发滤色镜为BP460-490,吸收滤色镜为BA515,分光镜为DM500,另加一绿通道液晶滤光片,激发出Rhodamine-123的荧光。电荷耦合器件采集图像并送入计算机。重复上述步骤,采用DiOC6[3]标记内质网,BODIPY标记高尔基体,Lucifer Yellow标记细胞溶酶体,激发条件同Rhodamine-123。分别采集同一视野靶细胞DiOC6[3]、BODIPY或Lucifer Yellow的荧光图像,完成全部图像采集并储存在计算机中。④激光共聚焦显微成像系统的图像采集:选择经4种探针染色的靶细胞,使用氩离子激光器在488nm激发Rhodamine-123,Rhodamine-123荧光通过配置有530/60-G发射滤光片的通道1探测。重复上述步骤,在488nm激发DiOC6[3]和BODIPY,在457nm激发Lucifer yellow,3种荧光均由通道1探测,后2个探针的发射滤光片的配置为515/30-G,DiOC6[3]选择530/60-G。由光电倍增管接收信号并传输入计算机成像。结果:①高分辨率荧光成像系统所采集图像,靶细胞中由荧光探针Rhodamine-123染色的线粒体呈多个典型的小棒状或卵圆状,聚集在核周;Lucifer yellow染色的溶酶体呈多个非对称球型,在胞浆内随机分布,颗粒尺寸通常大于线粒体;荧光探针DiOC6[3]着色的内质网占据胞浆的很大空间,以囊状聚集为特征;BODIPY特异性地结合在高尔基体上,荧光图像显示围绕在细胞核周围呈条索状。②与高分辨率荧光成像系统比较,激光共聚焦显微成像系统所采集的图像其荧光强度基本相同,但分辨率低、细节显示模糊、胞浆中细胞器的准确分布信息和形态特征显示效果欠佳。结论:两种荧光显微成像系统均可采集到细胞器探针的荧光图像。但高分辨率荧光成像系统采集的荧光图像具有细节清晰、分辨度高、准确显示胞浆中细胞器的分布信息和形态特征等优点。     

内镜下氩离子凝固术与光动力疗法治疗2例放射性肠炎出血

目的 探讨放射性肠炎出血的有效治疗方法.方法 对临床确诊的放射性肠炎出血患者予以内镜下氩离子凝固术与光动力疗法.结果 58岁男性患者,因前列腺癌接受放射治疗,放疗术后半年出现便血.结肠镜检查:距肛门4～6cm直肠见弥漫扩张的毛细血管网伴新鲜渗血,确诊为放射性肠炎出血.予以内镜下氩离子凝固术(APC),随访半年无复发出血.52岁女性患者,宫颈癌放射治疗术后1年余,便血5个月.结肠镜检查:距肛门4～8cm直肠见弥漫扩张的畸形毛细血管网伴新鲜渗血,确诊为放射性肠炎出血.予以内镜下光动力疗法(PDT),随访2年无复发出血.结论 内镜下APC与PDT治疗放射性肠炎出血安全有效,能否作为放射性肠炎出血的一线治疗手段尚需临床进一步研究.     

应用定量分析法与图像观察法对光敏剂细胞内分布的对比研究

目的 探讨定量分析法在光敏剂亚细胞定位研究中的应用特点,并与图像观察法进行比较. 方法 传代培养A549肺癌细胞,分别与光敏剂血卟啉单甲醚孵共同孵育2,12,24 h.选择四种特异性细胞器荧光探针Rhodamine-123、Lucifer yellow、DiOC6(3)和BODIPY分别标记细胞内线粒体、溶酶体、内质网和高尔基体,倒置荧光显微镜和致冷CCD探测HMME和探针荧光图像.观察细胞中光敏剂和荧光探针各自的荧光图像并分析光敏剂在细胞中的分布特点.定量计算探针荧光高强度区域与细胞区域内的HMME荧光均量比IB/IA. 结果 图像观察法显示,孵育2,12,24 h,细胞内HMME几乎不进入细胞核,而主要弥散分布于细胞质及各细胞器.定量结果显示: A549肺癌细胞内,2 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、溶酶体、线粒体、内质网;12 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、溶酶体、内质网、线粒体;24 h时IB/IA由高到低为:高尔基体、内质网、溶酶体、线粒体;高尔基体组IB/IA随时间上升. 结论 应用定量分析法较图像观察法更可以准确反映出HMME在细胞内分布随着孵育时间变化的特点.     

高功率CO2激光心肌打孔机的研制及临床应用

目的：研制用于激光心肌打孔血运重建术（TMLR）的高功率CO2激光治疗仪，并对其生物学效应及临床应用效果进行评价。方法：采用激光合成方法研制产生大功率CO2激光的心脏打孔机，分别在有机玻璃块，犬离体心脏和活体心肌缺血模型上进行激光心肌打孔实验，以检验合成光束的生物物理特性，选择安全有效的激光心肌打孔参数。在此基础上，使用该仪器为65例冠心病病人行TMLR手术并观察效果。结果：在有机玻璃和离体猪心打孔显示孔道孔径，深度可以满足TMLR的使用要求，使用该仪器在犬缺血心肌打孔形成透壁孔道，1周年镜下可见孔道通畅，65例接受TMLR手术患者，3例分别于术后第3天、第4天及第8天因呼吸衰竭、心力衰竭及心律失常死亡，其余病人均顺利院，随访6－30个月，50例患者心绞痛明显减轻，其中37例较术前减少2级，15例减少1级，7例变化不明显，失访5例，26例术后行心肌放射性核素断层扫描，有21例心肌的孔区域的血流灌注比前术前明显增加。结论：合成高功率CO2心脏激光打孔机治疗仪在TMLR的动物实验及临床应用中安全有效。     

血卟啉单甲醚蛋白结合状态对其亚细胞分布的影响

目的探讨在不同种类血浆蛋白的条件下血卟啉单甲醚向细胞内转运及分布的特点.方法在不同种类血浆蛋白条件下,将血卟啉单甲醚(HMME)与传代培养HeLa细胞共同孵育2 h和12 h.采用荧光探针标记技术和细胞器-细胞荧光强度比值分析法对细胞内HMME进行亚细胞定位和定量分析.结果孵育2 h与12 h比较,不含血清组中4种细胞器内HMME的平均荧光光强比值都有升高,以线粒体、内质网和高尔基体较显著,溶酶体稍有升高;白蛋白(Alb)组中4种细胞器中溶酶体的HMME平均荧光光强比值升高较显著,其他3种细胞器则略有升高;低密度脂蛋白(LDL)组中4种细胞器中溶酶体内HMME的平均荧光光强比值升高更加显著,其他细胞器的HMME平均荧光光强比值升高幅度明显大于Alb组.结论在短时间内进入细胞的主要为游离型HMME,转运形式以单纯被动扩散为主,以高尔基体、线粒体和内质网等细胞器为主要分布位点,溶酶体次之.随着孵育时间的延长,HMME可以和白蛋白、低密度脂蛋白结合形成结合型HMME,以胞吞形式进入细胞,二者相比,和LDL结合的HMME更易穿过细胞膜,溶酶体吸收HMME能力增强.