poly(A)加尾的实时荧光定量PCR检测血清miR-124a表达及临床初步应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR Green I实时荧光定量PCR方法检测血清微小RNA(miR)-124a,并作临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-124aploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR Green I实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,定量血清中miR-124a的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-124a表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copies/uL范围内有良好的线性关系(r2=0.999),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-124a表达水平明显高于健康体检者(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR Green I实时荧光定量PCR方法能敏感、特异地检测血清中miR-124a的表达水平,为下一步临床应用的研究奠定了方法学基础。     

实时荧光定量PCR检测血清miR-375表达及临床应用

目的建立ploy(A)聚合酶加尾的SYBR GreenⅠ实时荧光定量聚合酶链反应(PCR)检测血清miR-375,并进行临床初步应用。方法用Trizol试剂提取血清总RNA。miR-375ploy(A)聚合酶加尾逆转录获得cDNA,进行SYBR GreenⅠ实时定量PCR扩增检测。制作C.elegans-miR-39模拟物浓度梯度稀释的标准曲线,绝对定量血清中miR-375的表达水平。结果该方法能定量检测血清miR-375表达水平,熔解曲线呈单峰,PCR扩增产物特异,在103~106 copy/μL范围内有良好的线性关系(r2=0.997),并且检测重复性好。糖尿病患者血清中miR-375表达水平明显高于健康体检者,差异有统计学意义(P0.05)。结论所建立的ploy(A)聚合酶加尾SYBR GreenⅠ实时荧光定量PCR能敏感、特异地检测血清中miR-375的表达水平,为下一步临床应用研究奠定了方法学基础。     

人核糖体蛋白S13的原核表达、纯化及多克隆抗体的制备

目的克隆人核糖体蛋白S13(ribosomal protein S13,RPS13)cDNA全长,构建原核表达质粒,诱导表达、纯化RPS13蛋白并制备其多克隆抗体。方法应用RT-PCR方法从胃癌多药耐药细胞SGC7901/VCR中扩增出RPS13的cDNA全长,利用DNA重组技术构建重组原核表达载体pET-28a( )-RPS13,双酶切及测序鉴定。将重组载体转化入大肠杆菌BL21中,筛选抗性克隆并经DNA测序证实。IPTG诱导融合蛋白的表达,利用镍离子亲和层析柱提纯融合蛋白,经SDS-PAGE和Western blot鉴定。用纯化的融合蛋白His-RPS13免疫BALB/c小鼠,ELISA法测定抗体效价,饱和硫酸铵沉淀法纯化抗体,Western blot检测抗体活性。结果RT-PCR扩增片段与预计目的基因片段大小一致;双酶切鉴定表明,重组表达载体pET-28a( )-RPS13构建成功,DNA测序结果显示所获基因序列与GenBank中收录完全相同。IPTG诱导3h后,经SDS-PAGE检测显示在Mr19000处出现一新生条带,与预计的融合白大小一致;利用抗His标签的抗体进行Western blot,结果证实融合蛋白表达成功。其免疫血清经Western blot证实可特异性的识别蛋白RPS13。结论成功地获得了RPS13的编码基因序列,并获得了纯化的RPS13蛋白质,为制备RPS13的单克隆抗体、进一步研究RPS13在肿瘤中的作用奠定了基础。     

Id1真核表达载体的构建及胃黏膜上皮细胞系的转染

目的: 扩增Id1基因,构建Id1真核表达载体pcDNA3.1/V5HisA-Id1. 方法: 以胃癌细胞SGC7901cDNA为模板,以Id1基因编码区外的两段特异性序列为引物,获得Id1基因的全长. 将目的基因插入载体pUCm-T,经序列测定证实后,亚克隆至pcDNA3.1/V5HisA并经酶切鉴定. 采用脂质体转染的方法将重组质粒稳定转染至胃粘膜上皮永生化细胞系GES-1中. 结果: 经RT-PCR方法扩增出大小为608 bp的基因片断,序列测定其编码序列及读框正确. 亚克隆经酶切鉴定正确. 经过8 wk G418筛选后,获得稳定表达Id1的细胞亚系. 经Western blotting 证实,Id1蛋白表达水平高于对照组. 结论: 成功地构建了Id1真核表达载体,为进一步研究其在胃癌细胞中的作用奠定了基础.     

医疗保险参保人住院费用自负比例的分析

在我国13．2亿人中,参加基本医疗保险的已达11．3亿人,其中城镇职工医保参保人数突破2亿人,城镇居民医保参保人数1．17亿人。我省近年来开始实行医疗保障制度改革,全面推行城镇职工基本医疗保险制度,近期又逐步推行城镇居民医疗保险制度,为全省大部分群体提供了有力的医疗保障。社会基本医疗保险的基本原则是“低水平,广覆盖”,即尽可能最大范围内保障最基本的医疗需求。     

TWIST小干扰RNA对胃癌细胞生物学行为影响的研究

目的:研究转录因子TWIST对胃癌细胞生物学行为的影响.方法:构建TWIST小干扰RNA,转染胃癌细胞系SGC7901,经G418筛选和Western blot鉴定TWIST低表达胃癌细胞系,MTT法测定细胞生长曲线,流式细胞仪技术检测细胞凋亡及细胞周期,Western blot法检测bax、bcl-2蛋白表达水平.结果:建立了TWIST低表达的胃癌细胞系SGC7901/pSi-TW,与亲本细胞及空载体转染细胞相比,SGC7901/pSi-TW细胞生长速度减慢、增殖指数降低、细胞凋亡增加、bcl-2表达下降、bax表达升高、bcl-2/bax比值降低.结论:TWIST在胃癌细胞的生长、细胞周期、凋亡中具有重要作用.     

PI3K／Akt途径在朊蛋白介导胃癌耐药中的作用研究

目的：探讨P13K／Akt途径在朊蛋白（PrPc）介导胃癌耐药中的作用。方法：脂质体基因转染法建立高表达PrPc的胃癌细胞亚系。Western印迹检测转染细胞中Akt蛋白的表达。噻唑蓝（MTT）比色法测定单独或联用P13K抑制剂LY294002时转染细胞对化疗药物的敏感性。流式细胞仪检测单独或联用LY294002时转染细胞内阿霉素蓄积和潴留。结果：将PrPc正义载体pcDNA—PrP转入SGC7901,成功建立PrPc高表达胃癌细胞亚系并命名为PS;空载体转染细胞命名为BS。Western—Blot显示磷酸化Akt在PS中的表达较Bs及SGC7901增高,而三者的总Akt则无差别。未经LY294002处理时,在阿霉素或长春新碱的作用下,PS的存活率分别为91．4％±3．4％和89．4％±3．8％,较BS（79．2％±4．3％和75．9％±2．1％）明显增高（均）,PS细胞内阿霉素蓄积量和潴留量分别为4．4±0．3和4．2±0．4,明显低于BS（8．2±0．5和8．0±0．3）（均）;当联合LY294002处理后,PS在两种药物作用下的存活率均随着LY294002浓度的增加逐渐降低,并均在LY294002为30tLmol／L时接近BS（均）,PS细胞内阿霉素蓄积量和潴留量逐渐增高,并均在LY294002为30μmol／L时接近BS（均）。结论：PrPc介导的胃癌耐药与P13K／Akt途径活性密切相关,抑制P13K／Akt途径活性可逆转PrPc介导的胃癌耐药。     

基于深度收缩自编码网络的飞行员疲劳状态识别

针对飞行员疲劳状态识别的复杂性,本文基于脑电信号提出一种新的深度学习模型。一方面,利用小波包变换对飞行员脑电信号进行多尺度分解,提取了脑电信号的四个节律波段:δ波(0.4~3 Hz)、θ波(4~7 Hz)、α波(8~13 Hz)和β波(14~30 Hz),将重组的波段信号作为纯净的脑电信号。另一方面,提出一种基于深度收缩自编码网络的飞行员疲劳状态识别模型,并与其他方法进行比较。实验结果显示,针对飞行员疲劳状态识别问题,所建立的新的深度学习模型具有很好的识别效果,识别准确率高达91.67%。因此,研究基于深度收缩自编码网络的飞行员疲劳状态识别具有重要意义。     

富马酸氯马斯汀复合地塞米松对全麻患者米库氯铵组胺释放作用的影响

目的 观察麻醉前注射富马酸氯马斯汀复合地塞米松对全麻患者米库氯胺组胺释放的影响.方法 选择2018年3—12月拟行全麻择期手术患者120例,男54例,女66例,年龄20～60岁,ASAⅠ或Ⅱ级.采用随机数字表法将患者分为四组:富马酸氯马斯汀组(F组)、地塞米松组(D组)、富马酸氯马斯汀复合地塞米松组(DF组)和对照组(...