大鼠肥大细胞Fas的表达与功能研究

目的 研究大鼠肥大细胞表面Fas的表达情况及其功能。方法 应用RT-PCR和免疫印迹法检测Fas的转录和表达,并用免疫细胞化学法定位;应用annexinV流式细胞仪检测经抗大鼠Fas多克隆抗体诱导的RBL-2H3细胞的凋亡情况。结果 RT-PCR扩增出Fas细胞外区474bp片段,免疫印迹证实肥大细胞有蛋白表达,免疫细胞化学证实肥大细胞膜表面有Fas表达,annexinV流式细胞仪检测发现在抗大鼠Fas多克隆抗体的诱导下RBL-2H3出现凋亡。结论 大鼠肥大细胞表面表达Fas,通过激活Fas途径可诱导肥大细胞凋亡。     

聚肌苷酸胞苷酸对人肝癌细胞的增殖抑制和凋亡诱导作用

目的 探讨聚肌苷酸胞苷酸(Poly I:C)对体外培养的人肝癌细胞SMMC-7721生长的增殖抑制和凋亡诱导作用,并探讨其作用机制.方法 肝癌SMMC-7721细胞经不同剂量Poly I:C作用后,CCK-8法检测细胞增殖抑制,流式细胞仪检测细胞凋亡及细胞周期变化,SYBR-Green荧光定量PCR检测TLR3、TRIF、IFN-βmRNA的表达.结果 Poly I:C 高剂量组的生长抑制率最高,高、中、低三个剂量组间比较差异有显著性(P<0.05).Poly I:C同一剂量组生长抑制率72 h最高,48 h次之,24 h时最低,每组不同时间点比较差异有显著性(P<0.05).流式细胞仪检测结果 显示Poly I:C可诱导SMMC-7721细胞凋亡,随浓度增加和时间的延长凋亡率逐渐升高(P<0.05).Poly I:C组细胞处于G1期的百分率明显高于对照组.TLR3、TRIF、IFN-βmRNA的表达均增高,三组间比较差异有显著性(P<0.05).结论 Poly I:C对体外培养的SMMC-7721有显著的增殖抑制作用,呈剂量依赖性和时间依赖性,其机制可能与细胞周期阻滞,TLR3通路激活,诱导产生IFN-β,诱导细胞凋亡有关.     

131I人源抗HBs Fab在裸鼠人肝癌模型定位的研究

目的在人源抗HBsFab表达载体构建、抗体片段表达及纯化成功后,进行放射免疫显像研究,以评价其在动物模型中的免疫导向活性。方法用131I标记人源抗HBsFab,经腹腔注射l,3,5,7d后行裸鼠人肝癌模型放射免疫显像,于第7天作组织分布测定,并以鼠源抗HBsAg单抗为对照进行比较。结果实验组在标记抗体注入后第3天即获阳性显像,第5天更加清晰,此时人源抗HBsFab、鼠源单抗及无关Fab的瘤／肝放射性比值分别为5＞4,4＞0和0＞9。结论人源抗HBsFab具有良好的导向活性,为其用于肝癌的导向治疗提供了实验依据。     

VEGF-C mRNA和VEGFR-3 mRNA实时荧光定量检测方法的建立及初步应用

目的建立检测血管内皮生长因子-C（VEGF-C）mRNA和血管内皮生长因子受体-3（VEGFR-3）mRNA的实时荧光定量逆转录聚合酶链反应（FO-RT-PCR）方法,并在食管癌组织中作初步应用。方法采用TaqMan荧光探针技术,分别以pMD18-VEGF-C和pMD18-VEGFR-3质粒作为定量模板,应用循环阈值（Ct）定量起始模板,建立检测食管癌组织的VEGF-CmRNA和VEG—FR-3tuRNA的实时FQ-RT-PCR方法。结果所建方法的线性范围：VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA均为10^3～10^8拷贝／μg总RNA;测定VEGF-C mRNA低值的批内、批间变异系数（CV）分别为7．07％和9．04％,测定VDGF-CmRNA高值的批内、批间CV分别为7．55％和10．28％;测定VEGFR-3mRNA低值的批内、批间CV分别为7．69％和12．49％,测定VEGFR-3mRNA高值的批内、批间CV分别为7．31％和9．17％。24例淋巴结转移食管癌患者癌组织VEGF-CmRNA和VEG—FR-3 mRNA的测定范围分别为3．69&#215;10^4～9．44&#215;10^6拷贝／μg总RNA和2．54&#215;10^4～8．03&#215;10^6拷贝／μg总RNA,均值分别为2．18&#215;10^6拷贝／μg总RNA和2．27&#215;10^6拷贝／μg总RNA。16例无淋巴结转移食管癌患者癌组织VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA的测定范围分别为2．32&#215;10^3～5．85&#215;10^5拷贝／μg总RNA和7．31&#215;10^2～8．21&#215;10^4拷贝／μg总RNA,均值分别为1．08&#215;10^5拷贝／μg总RNA和1．68&#215;10^4拷贝／μg总RNA。提示有淋巴结转移的食管癌组织VEGF-C和VEG—FR-3基因表达水平上调。结论本组建立的检测VEGF-CmRNA和VEGFR-3mRNA的实时FQ-RT-PCR方法灵敏、准确、稳定、重复性好,可供VEGF-C、VEGFR-3基因表达的临床检测和研究应用。     

聚苯乙烯肽亲合标签和葡萄球菌蛋白A免疫球蛋白Fc结合区融合蛋白的克隆表达与应用

目的应用生物工程技术克隆、表达聚苯乙烯肽（PS）亲和标签（PStag）和葡萄球菌蛋白A（SPA）免疫球蛋白（IgG）-Fc结合区（ZZ）融合蛋白,在大肠埃希菌BL21中进行高效表达并初步纯化,为优化、提升免疫检测方法奠定基础。方法应用基因合成技术串联SPA-ZZ结构域和PStag基因,构建重组表达质粒pPS-SPA,经酶切和测序确认,将阳性重组质粒转化BL21感受态细菌,异丙基-β-D-硫代半乳糖苷（IPTG）诱导表达,十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）和免疫转印试验（Western blot）鉴定表达和纯化产物;直接酶联免疫吸附试验（ELISA）验证融合表达产物对亲水ELISA板的表面吸附特性和定向结合兔、鼠IgG-Fc区的效果。结果在合成基因的基础上构建的表达载体经序列分析与限制性酶切证实了串联基因的正确克隆,PAGE结果表明可诱导高表达PStag-SPA,纯化产物对亲水ELISA板的吸附能力较高,表达产物对兔与鼠IgG具有定向吸附能力。结论重组表达的PStag-SPA具有对ELISA板的黏着能力和定向结合兔、鼠IgG-Fc的应用潜力,为优化酶免疫检测技术提供了技术支持。     

人白细胞介素10重组腺病毒载体的构建

目的构建人白细胞介素 10重组腺病毒载体 ,为真核表达及其临床研究提供实验基础。方法自行设计一对引物 ,应用逆转录多聚酶链式反应 ( RT- PCR )技术 ,从活化的正常人外周血单个核细胞中扩增出 h IL - 10 c DNA,并将h IL - 10 c DNA克隆到腺病毒载体 p Ad CMV - L ink1中 ,构建 p Ad CMV/ h IL - 10表达质粒。将此表达质粒与腺病毒重组质粒p JM17共转染 2 93细胞 ,通过同源重组产生 h IL - 10重组腺病毒。结果扩增到的 c DNA片段经酶切鉴定、PCR扩增、DNA测序最终确定为 h IL- 10 c DNA;所得人白细胞介素 10重组腺病毒滴度为 1.9× 10 9pfu/ m L。结论本实验为今后研究 h IL- 10的生物学活性及炎症性疾病的基因治疗提供了基础     

游离与总前列腺特异性抗原及其比值对前列腺癌鉴别的临床意义

目的了解总前列腺特异性抗原 (T- PSA,总 - PSA)、游离前列腺特异性抗原 (F- PSA,游离 - PSA)以及 F-PSA和 T- PSA比值 (F- PSA/ T- PSA,F/ T) ,对良性前列腺增生 (BPH )和前列腺癌患者的鉴别价值。方法采用微粒子酶免疫技术 ,测定 BPH和前列腺癌患者的血清 T- PSA、F- PSA,并计算 F/ T比值。结果 12 3例 BPH者的 T-PSA为 (6 .5± 3.1)μg/ L ,小于 4μg/ L占 6 6 .7% ;F- PSA为 (1.38± 1.18)μg/ L ,小于 0 .93μg/ L占 6 3.4% ;F/ T为(2 1.2± 3.3) %。 5 9例前列腺癌患者的 T- PSA为 (36 .41± 2 2 .17)μg/ L ,大于 4μg/ L的占 93.2 % ;F- PSA为 (2 .2 6± 2 .18)μg/ L大于 0 .93μg/ L的占 76 % ;F/ T为 (11.9± 4.4) %。统计上 F/ T比值显著低于 BPH组。 T- PSA在 4～ 10μg/ L时 ,F/ T比值差异更明显。结论以 T- PSA 4μg/ L、F- PSA 0 .93μg/ L为临界值有意义 ;对 T- PSA在 4～ 10μg/ L时 ,结合应用 F/ T比值有利于对低 T- PSA的前列腺癌患者及早作出鉴别     

淋巴细胞CD2分子与Ea花环相关性

E花环和Ea花环试验作为一种细胞免疫功能检查,随着流式细胞仪的应用有被CD2测定取代的趋势。E花环的形成是T细胞借助其表面的羊红细胞受体(CD2分子)粘附羊红细胞所致。人体约95%的外周血T细胞表达这一受体,但由于受体亲合力与热动力学的原因,淋巴细胞形成花环的能力有高低之分,有少数细胞能在室温下迅速形成花环,即Ea花环,后者较之E花环更能揭示受试者的免疫机能,是一项较为敏感的细胞免疫功能检测指标[1]。Ea花环的形成表明这类T细胞对羊红细胞具有更高的亲合力,进一步阐明T细胞表面CD2分子与Ea花环实验的相关性对指导临床诊疗有一…     

Her2／neu基因定量检测方法的建立

目的 建立人Her2/neu基因mRNA荧光定量检测方法 ,评价该方法 的准确性及稳定性.方法 基于TaqMan荧光探针技术,构建克隆栽体pGEM-T-Her2/neu作为定量模板,通过荧光强度达到一定阈值时的循环数来定量起始模板,以建立实时荧光定量RT-PCR方法;并且在GeneAmp 5700型检测议上测定10例经免疫组织化学法证实Her2/neu表达卅的乳腺癌组织标本,同时对最大值及最小值重复测量.结果 Her2/neu动态检测范围为103～107拷贝/μg RNA(r≥0.996),内参β-actin的动态检测范围为103～108拷贝/μg RNA(r>0.998).10例检测癌组织的Her2/neu表达范围为6.6×104～4.7×106拷贝/μg,最大值10次重复测量值为(4.65±0.55)×106>拷贝/μg,最小值10次重复测量值为(7.36±0.75)×104拷贝/μg.结论 成功建立人Her2/neu基因表达RT-PCR检测方法 ,具有较高的准确性和稳定性,可用于检测Her2/neu基因表达水平,为进一步应用于乳腺癌预后判断及术后治疗方案的选择奠定了基础.     

κ、λ轻链C区基因的克隆与表达

目的 利用pBAd／gⅢA表达载体和大肠杆菌Top 10克隆和表达κ、λ轻链C区基因片段，探索生物工程技术制备小分子抗原的可行性。方法 经RT-PCR从正常人的外周血淋巴细胞mRNA中扩增出κ、λ轻链恒定区基因，限制性双酶切后分别克隆到同样酶切的pBAd／gⅢA质粒中，转化大肠杆菌。酶切鉴定与PCR法筛选出阳性克隆菌株，经Arabinose诱导表达出κ、λ轻链片段。Ni^2 -NTA亲和层析纯化后，以150mg/mL SDS-PAGE与Westem blot鉴定纯化产物，并测定蛋白的相对浓度。结果 SDS-PAGE与Westem blot结果显示，纯化后的产物在Mt 16000处呈致密的单一条带，与克隆基因表达产物的相对分子质量一致，该带经HRP标记的羊抗人IgG Fab抗体证实为抗体片段成分。结论 κ、λ轻链C区基因的pBAd／gⅢA表达在技术上是可行的，该原核系统表达的片段具抗原性，为后续的开发应用打下了基础。