穿膜肽增强聚乙烯亚胺介导的基因转染效率的机制研究

目的研究穿膜肽增强支链聚乙烯亚胺（BPEI）在CHO-K1细胞中的基因转染效率的机制。方法分别合成蜂毒肽（melittin）及其疏水核心区MT20,利用圆二色光谱（CD）分析其二级结构;通过溶血试验比较二者穿透细胞膜的能力;加入蜂毒肽和MT20前后,观察钙黄绿素（calcein）在HeLa细胞内的分布情况。分别将蜂毒肽或MT20与BPEI按一定比例混合,以荧光素酶（luciferase）为报告基因,检测荧光素酶在CHO-K1细胞中的转染效率;以MTT法检测基因转染后的细胞毒性。结果在模拟膜环境的甲醇溶液中,蜂毒肽和MT20都呈现一定的α-螺旋结构,比例分别为59.63%和35.67%,说明其二级结构与之穿膜功能相关;蜂毒肽只能在中性条件下穿透细胞膜导致红细胞溶血,而MT20在中性和酸性条件下都具有穿膜能力;加入蜂毒肽和MT20后能够促进钙黄绿素在MT20组中呈弥散分布,在蜂毒肽组中呈颗粒状分布并且在核仁内蓄积;MT20和蜂毒肽都能够增强BPEI在CHO-K1细胞中的基因转染效率,其中MT20的增强作用更强且细胞毒性较蜂毒肽以及单独使用BPEI和Lipofectamine 2000时要低。结论蜂毒肽的疏水核心区MT20通过增加PEI/DNA复合物颗粒从内含体逃逸并促进其进入细胞核而增加其基因转染效率,是一种低毒的基因转染增强剂,有可能在难以转染的细胞系中发挥重要作用。     

Prdm1基因敲除小鼠的繁育和基因型鉴定

本研究目的是繁育和鉴定prdm1基因敲除的小鼠,为进一步研究Blimp-1蛋白的功能奠定基础。将所引进的2种转基因纯合子小鼠B6.prdm1flox/flox和B6.Lck-Cre进行饲养并繁殖,繁殖成功后获得第1代小鼠,将第1代小鼠再次进行交配获得基因型为:B6.prdm1wild/wild.Lck-Cre、B6.prdm1wild/wild、B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre、B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6.prdm1flox/wild。提取第2代小鼠基因组DNA,应用聚合酶链反应(PCR)扩增Cre和loxp基因片段后琼脂糖凝胶电泳分别检测cre和loxp基因组DNA的大小。取基因型为B6.prdm1flox/flox.Lck-Cre即为条件性基因prdm1敲除小鼠,选择B6.prdm1flox/wild.Lck-Cre、B6.prdm1flox/flox、B6小鼠作为对照,应用磁珠分选脾脏T淋巴细胞和B淋巴细胞,并应用Western blot方法检测Blimp-1目的蛋白。结果表明,2种转基因纯合子小鼠均有繁殖能力,其子代相互繁殖后第2代小鼠分离比例基本符合孟德尔遗传规律,亦可以成功获得较多的prdm1基因敲除小鼠。结论:应用Cre-loxp系统可以成功地获得prdm1基因敲除的小鼠。     

CD146与Ki67在葡萄胎组织中的表达及临床意义

目的检测CD146与Ki67在葡萄胎病变组织中的表达,以评估其临床意义。方法采用免疫组化SP法检测36例HM(完全性葡萄胎21例,部分性葡萄胎15例)与阴性对照组(正常人工流产组织18例)组织中CD146与Ki67的表达情况,并进行术后随访、观察预后。结果与正常人工流产组织比较,CD146与Ki67在HM组织中呈高表达,差异有统计学意义(P<0.05);CD146在完全性HM病变组织中度阳性的表达率为95%(20/21),在部分性HM病变组织中为13%(2/15);Ki67在完全性HM病变组织中度阳性的表达率为90%(19/21),在部分性HM病变组织中为7%(1/15),提示CD146与Ki67在完全性HM中的表达强度较部分性HM明显增高,差异有统计学意义(P<0.05)。结论 CD146与Ki67可以作为辅助鉴别HM病理分类、指导HM治疗及预后评估的标志物。     

纳米碳颗粒定位法在腹腔镜结肠癌手术中的应用

目的评价纳米碳标记肿瘤在腹腔镜结肠癌手术中的应用前景。方法在2009年7月～2011年7月选取65例结肠癌手术病人。取31例经肠镜注射纳米碳颗粒悬液定位肿瘤位置,其他34例未处理做阴性对照。结果在所有标记的病人中标记定位处染色明显清楚,病人没有腹痛、发热、腹泻等症状。统计两组患者的术中确定病灶时间、手术时间和术中出血量,发现有明显差别,且有统计学意义(P<0.01或0.05)。结论纳米碳标记在腹腔镜结肠手术中安全且有效。     

丹参酮Ⅱ A对阿尔茨海默病模型大鼠海马MMP 2、iNOS表达及自由基释放的影响

目的探讨中药丹参酮ⅡA(TanⅡA)对AD模型大鼠学习记忆、海马内基质金属蛋白酶(MMP-2)、诱导型一氧化氮合酶(iNOS)表达及自由基释放的影响及作用机制。方法采用β-淀粉样蛋白(Aβ)定向注射法建立AD大鼠模型,并使用TanⅡA干预,通过观察大鼠学习记忆能力、定量分析大鼠海马MMP-2和iNOS基因及蛋白表达差异及表达相关性、自由基释放量的影响以阐明其作用机制。结果与正常对照组相比,Aβ注射法所建立AD模型大鼠海马内iNOS及MMP-2的表达显著增高(P0.05),两者的表达在mRNA及蛋白水平均正相关(P0.05)。AD大鼠海马内诱导释放的一氧化氮(NO)、ONOO-及活性氧(ROS)自由基含量显著增高(P0.05),同时AD模型组大鼠的学习记忆能力明显下降。而TanⅡA(50mg/kg)干预可显著降低AD大鼠海马内的NO、ONOO-及ROS含量,并降低iNOS(P0.05)及MMP-2蛋白的表达(P0.01),明显改善AD模型大鼠的学习记忆能力。结论TanⅡA可有效缓解AD症状,作用机制可能与抑制AD诱导的iNOS及MMP-2蛋白的表达,减少氧化性毒害自由基的产生,抑制氧化应激损伤有关。     

肾上腺素与rhG—CSF协同动员小鼠造血干祖细胞的研究

目的通过比较肾上腺素和重组人粒细胞集落刺激因子（rhG—CSF）单独或联合应用动员小鼠外周血造血干祖细胞（HSPC）的效果,以了解肾上腺素对HSPC的动员作用,为临床制定更为优良的动员方案奠定实验方面的基础。方法BALB／c小鼠48只,随机分成4组,每组12只。A组作为对照组,皮下注射生理盐水（NS）100μl·d^-1;B组皮下注射rhG—CSF250μg·kg^-1·d^-1;C组腹腔注射肾上腺素2．5mg·kg^-1·d^-1;D组皮下注射rhG—CSF250μg·kg^-1·d^-1＋腹腔注射肾上腺素2．5mg·kg^-1·d^-1（rhG—CSF后3h）,各组均连续用药5天。动态观察各组小鼠外周血中自细胞数（WBC）、Lin^-c—kit^＋（KL）、Lin^-c—kit^＋Sca-1^＋（KSL）细胞比例的变化。结果D组外周血WBC数及KL、KSL细胞比例明显高于B组（P〈0．05）或C组及A组（P〈0．01）;B组外周血WBC数及KL、KSL细胞比例明显高于C组及A组（P〈0．01）;C组外周血WBC数明显高于A组（P〈0．01）,但KL、KSL细胞比例与A组比较无显著性差异（P〉0．05）。结论肾上腺素可协同rhG—CSF参与HSPC的动员。     

急性酒精中毒致代谢紊乱的临床特点及救治体会

目的:探讨急性酒精中毒患者的钾、钠、氯、糖及酸碱紊乱的临床特点,提出救治方案.方法:根据意识障碍程度将重度酒精中毒患者156例分为昏睡组和昏迷组,分别测定血液中的乙醇浓度及血钾、钠、氯、糖及 pH值的变化;救治方法以液体治疗、纳络嗣应用及血液透析为主.结果:两组患者血液中乙醇浓度相比有显著性差异(P<0.01).代谢紊乱变化以代谢性酸中毒最为常见,达47.7%,其次为低钠、低钾和低氯,血糖的变化呈多样性.昏迷组患者代谢性酸中毒、低钠、低钾和低氯的发生率明显高于昏睡组(P<0.05).经有效治疗后两组患者均在入院后24h内出院.结论:量度急桂酒精中毒有较明显的代谢紊乱,应予以重视.液体治疗、纳络嗣的应用和血液透析是确切有效的治疗方法.     

移植预处理后肝脏内皮的电镜制作方法

目的介绍一种移植预处理后肝脏内皮的电镜制作方法。方法将30只C57BL/6小鼠随机均分为A组(60Co 7.5 Gy致死量照射)、B组(60Co 5.0 Gy减低剂量照射)和C组(正常对照),通过透射电镜定期观察肝脏内皮变化。结果透射电镜下可见:A组肝脏内皮细胞核碎裂、内皮破坏严重;B组染色质边集,内皮无明显损伤;C组未见明显异常。结论对肝脏组织进行恰当的处理后,透射电镜下能清楚地观察到内皮细胞表面结构和内壁损伤的形态改变。     

温敏干细胞联合亚低温抵抗颅脑创伤后缺氧微环境

目的 观察温度敏感型干细胞联合亚低温在缺氧环境中的生长和增殖情况.方法 建立一种温度敏感型干细胞株,BrdU标记；体内研究通过建立液压冲击重型颅脑创伤模型、移植温敏干细胞和亚低温治疗,采用免疫组织化学检测损伤近缘BrdU的表达水平；体外研究通过低氧培养或低营养低熔点凝胶培养模型,调整培养箱温度(33℃或37℃),进行细胞计数,免疫细胞荧光检测PCNA或caspase3的表达；采用Western blot检测体内和体外HIF -1α的表达水平.结果 移植第7天,温敏干细胞联合亚低温组损伤近缘的BrdU阳性数量显著增多(P＜0.01)；低氧培养中,亚低温处理组较非处理组的细胞数量和PCNA表达明显增加,而亚低温联合温敏干细胞组的细胞数量和PCNA表达增加最为显著(P＜0.01)；低营养培养环境中,亚低温处理组较非处理组的caspase3表达明显减少,而亚低温联合温敏干细胞组的caspase3表达减少最为显著(P＜0.01)；体内和体外Western blot结果显示亚低温联合干细胞组HIF -1 α表达显著增加(P＜0.01).结论 温敏干细胞联合亚低温治疗可增加移植干细胞抵抗TBI后缺氧微环境的能力和提高移植干细胞的存活率,可为TBI后干细胞移植提供新且更为有效的方案.